同位素稀释/超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法测定牛蛙中50种兽药残留

目的建立同位素稀释/超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-Q-TOF-MS)测定牛蛙中50种兽药残留的分析方法。方法 样品用0.2%甲酸乙腈提取,经快速滤过型净化(multi-plug filtration cleanup,m-PFC)固相萃取柱处理,采用Phenomenex Kinetex C_(18)色谱柱分离,以0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,目标物在正离子全信息串联质谱扫描方式(mass spectrometry, MS^(E))下检测,内标法定量。结果 50种兽药在各自的质量浓度范围内线性关系良好,相关系数大于0.995,检出限为0.5~1.0μg/kg,加标回收率为79.4%~112.1%,相对标准偏差为3.7%~13.1%。结论 该方法前处理简单、结果准确,适用于牛蛙中50种兽药残留的快速检测。

非洲爪蟾与牛蛙骨骼标本制作及结构比较

为了解非洲爪蟾(Xenopus laevis)与牛蛙(Rana catesbiana Shaw)骨骼构造及其生理功能的差异,制作了非洲爪蟾和牛蛙骨骼标本,研究其各部骨骼结构,探讨骨骼结构与生理功能的相关性。结果表明,牛蛙有锄骨和锄骨齿,非洲爪蟾没有;牛蛙与非洲爪蟾四肢骨骼组成相同,但牛蛙前肢中各指指骨数目与非洲爪蟾相反;牛蛙与非洲爪蟾脊柱均由8块椎骨构成,但椎弓方向和脊柱形状不同;牛蛙肩带和胸部有肩胛骨、中胸骨和剑胸软骨,但非洲爪蟾没有;牛蛙与非洲爪蟾腰带组成相同但髋臼不同。同一种族的不同物种形态结构与生理功能都与其长期生长坏境密切相关,揭示了蛙类骨骼形态的环境适应性特征。

牛蛙皮肤抗菌肽Ranalexin基因的原核表达及其抑菌活性

为了验证重组抗菌肽Ranalexin的抑菌活性,提取牛蛙皮肤组织总RNA,经RT-PCR扩增抗菌肽基因ranalexin,克隆测序后,将该基因插入pGEX-3X融合表达载体,进行原核表达,通过改变IPTG剂量、培养液pH值、诱导表达温度和诱导时间优化表达条件,并采用谷胱甘肽氧化/还原系统对重组蛋白进行复性,用琼脂扩散法测定其体外抑菌活性.结果显示,扩增获得的牛蛙皮肤抗菌肽基因ranalexin大小为201bp,其序列与GenBank公布序列同源性达99.57%;正确构建了pGEX-3X-Ranalexin表达载体,最佳表达条件为IPTG终浓度1.0mmol?L-1、诱导时间5～6h;表达产物的分子质量约为34kDa,并以包涵体的形式表达,经复性纯化后该重组蛋白对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抑菌活性.说明牛蛙皮肤抗菌肽基因ranalexin的原核表达载体构建成功,并获得了具有抑菌活性的重组抗菌肽GST-Ranalexin.

一株牛蛙源虹彩病毒的分离及鉴定

用鲤鱼表皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprini cell line,EPC)从福建省某美洲牛蛙养殖场分离到一株病毒FJ049。感染病毒的EPC呈现细胞圆缩、颗粒增多、脱落等特征性病变。间接免疫荧光检测结果表明,感染FJ049的EPC细胞与虹彩病毒单克隆抗体反应并出现特异性的胞浆荧光。采用PCR对虹彩病毒主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守区域进行扩增,扩增出531 bp的特异性基因片段。MCP基因同源性和遗传进化分析结果表明分离株FJ049与沼泽绿牛蛙虹彩病毒RGV9808的核苷酸同源性最高,为99.8%,属于虹彩病毒科蛙病毒属。

利用GARP生态位模型预测牛蛙和薇甘菊在中国的地理分布

应用GARP软件预测外来种牛蛙和薇甘菊在中国的地理分布。结果表明,牛蛙在中国的适生分布范围极广,在144个分布点中随机选择50个得出的预测精确度达到95.74%;虽然目前薇甘菊的记录点不多,但预测图显示其适生区范围涉及长江以南的广大地区,这种势态应引起高度重视;还讨论了预测的精确度、预测图的特殊地区,及对它们的预警、防范和控制问题。

重金属Pb^(2+)对牛蛙生理活性的影响

本研究以牛蛙(Rana catesbiana)为材料,用氯化铅配制不同浓度的Pb2+溶液(10、20和40 mg/kg)。持续染毒7 d后,培养1 d,然后对牛蛙呼吸频率、心率、肌肉和神经组织兴奋阈值、总蛋白质含量、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性以及重金属Pb2+的残留量进行测定。结果表明,处理前牛蛙呼吸频率无显著差异,处理后呼吸频率有显著差异,心率随浓度的增大而降低。牛蛙肌肉和神经组织兴奋阈值随重金属Pb2+离子浓度的增大而增大,总蛋白质含量、MDA含量随Pb2+浓度的增大而升高,CAT活性随Pb2+浓度的增大而降低。在腹肌、后腿肌肉和肝脏中重金属Pb2+的残留量最多的是肝脏,其次是腹肌,最少的是后腿肌肉。

牛蛙黄杆菌IIB群病病原菌的研究

从广东省南澳县西山等养蛙场多次收集患黄杆菌病牛蛙,其症状是:歪头、狂游、双眼白内障和腹水等。从病蛙脑浆、眼底和腹水中分离到多株病原菌,急性毒性试验表明病原菌对健康牛蛙致病力强。取有代表性的981007-2等菌株进行系统的生理生化试验显示,革兰氏染色阴性、无鞭毛、无芽孢的短杆菌;分离菌株内毒素检验阳性;病原菌显示了对青霉素类药物高度耐药、好氧型、利用葡萄糖等生理、生化特性。经VITEK-AMS-60自动化检测系统鉴定为黄杆菌IIb群(Plavobacterium group IIb)。选用47种抗菌药物,通过K-B纸片扩散法对病原菌进行耐药性研究结果,分离菌株对38种抗菌药物显示耐药(占80.85％)、对4种药物中等敏感(占8.51％),仅对利福平、环丙沙星、氧氟沙星、氟啶酸、麦迪霉素等5种药物(占10.64％)敏感。应用试管稀释法测定上述5种敏感药物的平均MIC分别是0.19、0.27、0.53、2.40和10.2μg/ml。

牛蛙脑膜炎黄杆菌病病原菌的研究

从广东省揭西县坪下牛蛙养殖场收集患黄杆菌病的病蛙,其症状是歪头、狂游、双眼白内障、肝脏肿大充血,腹水严重。从病蛙脑髓、眼底等处分离到62菌株。经急性毒性试验证明分离菌株对健康牛蛙有较强的致病性。选用其中有代表性的981229—1等菌株进行系统的生理生化试验结果显示,981229—3等菌株革兰氏染色阴性、短直杆菌、无动力、无芽孢、好氧型、不利用葡萄糖。内毒素试验阳性。经VITEK-AMS-60自动化检测系统鉴定为脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meninosepticum)。选取47种抗菌药物,通过K—B纸片扩散法对分离菌进行耐药性试验结果显示,病原菌对40种试验药物耐药(85.11％)、中等敏感药物2种(4.26％)、敏感药物5种(10.64％)。以试管稀释法、测定分离菌株对5种敏感药物的平均 MIC分别是:利福平 0.24、环丙沙星 0.70、氧氟沙星 0.70、氟啶酸 1.20和麦迪霉素7.80μg/ml。

牛蛙肝肿大病的组织病理研究

本文报道由产气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．）引起的牛蛙（Ｒａｎａｃａｔｅｓｂｉａｎａ）肝肿大病的病理研究结果。观察表明，病蛙的组织病理变化主要表现为：皮肤淤血、炎性水肿，表皮细胞坏死、脱落。骨骼肌纤维肿胀变性，肌核肿大乃至固缩坏死。肠壁充血发炎，肠上皮肿大，进而萎缩变性、崩解脱落。肝索断裂、肝细胞肿大、颗粒变性，糖原颗粒减少甚至消失，局部细胞溶解、坏死。肾近曲小管上皮细胞颗粒变性、解体，肾小球扩张充血。脾脏红、白髓结构受损，脾窦扩张，网状细胞，巨噬细胞和嗜酸性细胞增多。

牛蛙各个生育阶段整体营养成份分析

对越冬后牛蛙各生育阶段的整体营养成份进行了分析。结果表明，粗蛋白含量高低顺序为：幼蛙＞雌成蛙＞雄成蛙＞蝌蚪；粗脂肪含量为：雄成蛙＞雌成蛙＞蝌蚪＞幼蛙；氨基酸总含量为：幼蛙＞雄成蛙＞雌成蛙＞蝌蚪；各发育阶段无机元素的总含量排名为：Ｃａ＞Ｐ＞Ｋ＞Ｎａ＞Ｍｇ＞Ｆｅ＞Ｚｎ＞Ｍｎ＞Ｃｕ。

饥饿与冬眠期牛蛙肝脏糖原含量及主要酶的活性变化

目的研究饥饿与冬眠期牛蛙肝脏糖原含量和非特异性酯酶(NSE)、碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POX)、琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性变化。方法应用冰冻切片、PAS染色法、酶组织化学技术及光密度定量分析。结果饥饿期肝糖原含量显著降低,冬眠期肝糖原含量与活动期无显著差异;NSE活性在活动期最高,饥饿期显著降低,冬眠期活性最低;ALP和POX活性在饥饿期均显著降低,冬眠期与活动期无显著差异;SDH活性在饥饿期和冬眠期均显著降低,活动期活性显著较高。结论饥饿和冬眠期牛蛙肝糖原含量变化不一致,其他酶类活性变化相一致,不同时期肝糖原含量和酶活性的变化与牛蛙生理状态有着较好的适应性。

人工养殖状态下牛蛙的生物学习性

牛蛙生长的最适温度为25-32℃,繁殖的最适温度为20-30℃.牛蛙以动物性食物为主,在不同的发育阶段,食性也不尽相同.当水温升到18℃以上时,牛蛙开始发情.牛蛙的产卵量与年龄、个体大小、营养条件及生态条件等有很大关系,一般情况下,产卵量自1万至5万粒不等.卵孵化的最适水温为25-28℃.蝌蚪完成变态发育需要77d.每年11月下旬至翌年3月份为牛蛙的越冬期.

牛蛙腐皮病病原菌分离鉴定及药敏试验

【目的】明确浙江嘉善某养殖场引起牛蛙腐皮病的致病菌,并探究益生菌与牛蛙腐皮病病原菌间的相互作用,为今后利用益生菌防控牛蛙腐皮病的发生提供技术支持。【方法】通过常规的细菌分离纯化、人工回归感染试验、生理生化特性鉴定及16S r DNA序列扩增,确定引起牛蛙腐皮病的致病菌;根据药敏试验筛选抗菌药物,并从生物防控的角度探究枯草芽孢杆菌等益生菌与致病菌间的相互作用。【结果】从患病牛蛙的内脏及体表溃烂处共分离获得9株疑似致病菌株,经人工回归感染试验确定菌株NWt-2为引起牛蛙腐皮病的致病菌;综合其形态学特征、生理生化特性及分子生物学鉴定结果,可确定菌株NWt-2为布韦不动杆菌(Acinetobacter bouvetii)。菌株NWt-2对丁胺卡那、庆大霉素、哌拉西林、头孢氨苄和硫酸阿米卡星等5种抗菌药物高度敏感,对青霉素、复方新诺明、诺氟沙星、氟苯尼考、复方磺胺嘧啶、盐酸林可霉素和盐酸大观林可霉素等7种抗菌药物不敏感(耐药)。浓度为105CFU/mL的枯草芽孢杆菌和紫色杆菌对菌株NWt-2有一定的抑制作用,抑菌圈直径分别为1.45±0.46和0.97±0.38 mm。【结论】布韦不动杆菌是引起浙江嘉善养殖牛蛙发生腐皮病的致病菌,可选用丁胺卡那、庆大霉素、哌拉西林、头孢氨苄和硫酸阿米卡星等抗菌药物进行防治。鉴于枯草芽孢杆菌对布韦不动杆菌具有一定的抑制效果,在当前病原菌对抗菌药物普遍存在耐药性的情况下,选择枯草芽孢杆菌等益生菌进行生物防控具有可行性。

基于生物信息技术的骨骼肌收缩实验教学方法改进路径探索

骨骼肌收缩实验是生理解剖学等课程的基础实验之一,同时也是生物学实验中必须掌握的实验技术之一,能够为以后有关实验打下基础。在进行骨骼肌收缩实验之前,需要掌握制备坐骨神经-腓肠肌标本的方法,并且标本制备质量的好坏直接关系到骨骼肌收缩实验现象是否显著。因此,文章将对影响坐骨神经-腓肠肌标本制备和影响骨骼肌收缩等多方面因素进行考察,并针对问题提出改进方法。

镉、铜、镍和铅等重金属离子抑制牛蛙消化道黏膜POX、NSE、SDH、ACP、ALP和ATPase活性

目的研究Cd^(2+)、Cu^(2+)、Ni^(2+)、Pb^(2+)等重金属离子对牛蛙(Rana catesbiana)消化道黏膜过氧化物酶(peroxidase,POX)、非特异性酯酶(nonspecific esterase,NSE)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)、酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase,ATPase)等6种重要酶活性的影响。方法在牛蛙消化道8个部位取样,采用冰冻切片和酶组织化学染色方法检测酶活性。选取酶活性较高的部位,用不同浓度的重金属溶液处理组织后检测重金属离子对酶活性的影响。结果POX主要分布于直肠,Cd^(2+)、Cu^(2+)、Ni^(2+)对其活性有不同程度抑制作用。NSE主要分布于十二指肠,Ni^(2+)、Pb^(2+)对其活性有显著抑制作用。SDH主要分布于胃体,其他部位酶活性较低,4种重金属对其活性都有显著抑制作用;相较于其他酶,SDH活性受影响程度更明显。ACP主要分布于胃幽门,Cu^(2+)、Pb^(2+)对其活性存在显著抑制作用。ALP主要分布在十二指肠,其它部位酶活性较低,Cu^(2+)、Pb^(2+)对其活性有显著抑制作用。ATPase主要分布于空肠,4种重金属都显著抑制其活性。结论牛蛙消化道黏膜不同酶对重金属离子的敏感性不同,SDH对重金属离子的敏感性最高,ATPase活性亦受四种重金属离子的抑制作用,表明重金属离子会通过抑制牛蛙能量代谢的过程影响其消化吸收功能。

美国青蛙成蛙健康养殖技术经济评价

本文通过2005-2006年两年的对照试验,对美国青蛙的成蛙健康养殖模式进行了技术经济评价,通过对土池养殖、水泥池养殖、网箱养殖三种模式的比较,发现水泥池养殖的成活率最高可达93.8%,起捕平均规格最大可达312g,饲料系数最低可为0.92,单位利润最高可达293.3元/m^2。水泥池养殖的各项指标与土池养殖和网箱养殖相比,均名列前茅,应该作为美国青蛙健康养殖的主推模式进行推广应用。同时,土池养殖模式因其成活率低、劳动强度大、效益不好而应被淘汰。

一株牛蛙源金黄杆菌的分离鉴定及其致病特性

【背景】美国牛蛙养殖过程中病害问题非常突出,尤其是细菌性病害,其病原种类多、病原菌复杂多样、蔓延速度快、发病死亡率高,一直是牛蛙养殖过程中防控的难点。【目的】确定从患病牛蛙体内分离到的一株细菌NW1203的分类地位和致病性。【方法】无菌操作从牛蛙体内取样划线分离细菌,通过形态观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列比对进行种属鉴定,通过人工感染、溶血性试验和病理切片观察分析其致病特性。【结果】经形态和生理生化鉴定及16S rRNA基因序列比对,菌株NW1203为金黄杆菌属细菌,与Chryseobacterium sp. F30的相似性达100%,进化树也显示该菌与金黄杆菌属细菌聚类;溶血性试验表明,菌株NW1203对绵羊、小鼠和牛蛙的血细胞都呈完全溶血;人工感染试验及感染病蛙的组织切片观察显示,菌株NW1203对牛蛙具有较强致病性,可引起牛蛙肝、肾、脾等主要组织严重病变,LD50为4.753×103 CFU/g。【结论】明确了菌株NW1203为牛蛙新病原,为牛蛙疾病的防控提供了理论依据。

牛蛙源达卡气单胞菌的分离鉴定及毒力特性分析

采用细菌形态与生化鉴定方法并结合16S rRNA及gyrA基因测序分析,对海南省文昌市某养殖场死亡牛蛙病变组织中分离获得的1株优势菌株WC0803进行鉴定,并对其进行致病性试验、药物敏感性试验及耐药基因和毒力基因检测。结果显示,该菌株为革兰阴性短杆菌,培养特性、生化反应与达卡气单胞菌(Aeromonas dhakensis)基本一致;16S rRNA和gyrA基因同源性及系统进化分析显示,WC0803菌株与达卡气单胞菌参考菌株同源性大于99%,且为同一进化分支。该菌对头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星等7种抗生素敏感,对头孢氨苄、万古霉素、磺胺异恶唑和链霉素等10种抗生素耐药;携带耐药基因qnrA、qnrS、ant3、tem、ctxM,毒力基因ascV、aer、act、ast、lip、ela和fla;对牛蛙的半数致死量(LD50)为4.68×10^(6)CFU/mL,具有较强的致病性。本研究首次从患病牛蛙体内分离出一株强致病性达卡气单胞菌,为该菌感染的防治提供科学依据。