靶向HBV cccDNA形成的部分药物研究进展

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是全球重要的公共卫生问题。现有的抗HBV药物,即核苷(酸)类似物(NAs)和干扰素(IFN)类药物,虽可有效抑制HBV复制,但无法彻底清除感染肝细胞内稳定存在的共价闭合环状DNA(cccDNA),患者难以实现完全治愈。本文简要综述近年来直接靶向HBV cccDNA形成的部分药物研究进展,为实现乙型肝炎治愈提供可能。

靶向cccDNA以实现慢性乙型肝炎治愈

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的重要公共问题,约有2.96亿慢性感染者。HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)以微染色体的形式稳定存在于被感染的肝细胞核内,难以被现有的抗病毒药物靶向清除,因此被认为是HBV感染慢性化的关键因素。为实现慢性乙型肝炎(CHB)的临床治愈甚至完全治愈,我们迫切需要针对cccDNA的治疗策略。我们总结了目前cccDNA形成和调控的相关机制,并讨论通过靶向cccDNA以实现乙型肝炎治愈的可能策略。

乙型肝炎患者抗病毒治疗过程中肝组织HBV cccDNA与血清学标志物变化的动态变化研究

目的探讨慢性乙型病毒性肝炎患者抗病毒治疗过程中肝组织乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)与相关血清学标志物变化。方法 88例乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性的慢性乙型病毒性肝炎患者给予恩替卡韦抗病毒治疗96周。分别于0、24周、48周、96周检测肝组织中和血清HBV cccDNA、血清HBV DNA、乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)、HBeAg定量,并分析肝组织HBV cccDNA与血清学标志物变化的关系。结果与基线比较,治疗后24周时患者肝组织HBV cccDNA,血清HBV cccDNA,血清HBV DNA和HBs Ag均显著降低(P<0.05或P<0.01);治疗后24周和48周比较:肝组织HBV cccDNA,血清HBV cccDNA,血清HBV DNA差异有统计学意义(P<0.01);48周与96周检测指标相比:肝组织HBV cccDNA定量差异无统计学意义(P>0.05);血清HBV DNA定量和血清HBV cccDNA定量差异有统计学意义(P<0.01)。血清HBs Ag和HBeAg差异无统计学意义(P>0.05)。结论血清HBV DNA定量和血清HBV cccDNA定量同步下降幅度大于肝组织cccDNA定量和HBs Ag、HBeAg定量,肝组织HBV cccDNA定量、HBs Ag、HBeAg定量在48周后逐步趋于稳定。血清HBs Ag、HBeAg定量与肝组织HBV cccDNA具有较高的一致性,血清HBs Ag、HBeAg定量检测能更准确、方便、快捷指导临床诊断。

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV cccDNA预测拉米夫定的治疗效果

目的:探讨慢性乙型肝炎拉米夫定治疗结束时,外周血单个核细胞(PBMC)中HBV cccDNA(乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA)检测对拉米夫定持续应答的预测作用. 方法:对慢性乙型肝炎患者17例进行拉米夫定治疗48 wk,获得完全或部分疗效(血清HBV DNA转阴, ALT复常,伴或不伴HBeAg血清转换),48 wk治疗结束时检测PBMC中HBV cccDNA,并对患者进行1 a的血清HBVDNA监测. 结果:治疗结束时PBMC中HBV cccDNA为阳性9例, 阴性8例.在PBMC中HBV cccDNA阳性者,停止治疗的1 a内所有患者的血清HBVDNA阳转.而PBMC中HBV cccDNA阴性者,1例血清HBVDNA阳转. 结论:拉米夫定治疗结束时PBMC中HBV cccDNA的检测可能对拉米夫定治疗能否获得持续应答具有预测价值.

乙型肝炎病毒cccDNA检测与血清学及病理诊断关系

目的建立和应用聚合酶链反应法(PCR),检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA),探讨慢性乙型肝炎肝组织HBV cccDNA与乙型肝炎的血清学及病理关系。方法分别采用PCR法检测慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA,同时用免疫组化法检测肝细胞中HBcAg、Pres1;荧光定量PCR法检测慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA载量;电发光化学方法检测慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒标志物。分析肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA载量、HBeAg、HBeAb,以及肝细胞内HBcAg、Pres1的关系。结果①127例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA载量呈正相关(P<0.01)。②127例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA阳性组与HBV cccDNA阴性组血清HBV DNA载量及肝细胞内HBcAg、Pres1无显著性差异(P>0.05)。③HBV cccDNA阳性组的HBeAg检出率明显高于HBV cccDNA阴性组,HBV cccDNA阴性组的HBeAb检出率明显高于HBV cccDNA阳性组。结论测定肝组织中HBV cccDNA,对于了解乙肝患者病情和传染性强弱以及评价肝脏炎症活动度有重要意义。

醌氧化还原酶1抑制剂双香豆素促进HBV X蛋白降解进而抑制cccDNA转录的机制研究

【据Journal of Hepatology2021年3月报道】题:醌氧化还原酶1抑制剂双香豆素促进HBV X蛋白降解进而抑制ccc DNA转录的机制研究(作者Cheng ST等)HBV ccc DNA在肝细胞核内持续稳定的存在,被认为是HBV感染慢性化、抗病毒治疗无法彻底清除以及停药后肝炎复发的最主要原因。HBV X蛋白(HBx)对HBV ccc DNA的转录过程发挥关键作用;促进HBx降解,则可能抑制ccc DNA转录。因此,开发靶向HBx的小分子化合物是达到"ccc DNA沉默清除"这一重要目标的可能途径。

乙型肝炎患者外周血单个核细胞HBV cccDNA含量的检测及其临床意义

[目的]采用实时荧光定量PCR的方法检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV cccDNA的含量,并探讨其临床意义。[方法]应用实时荧光PCR(RT-PCR)方法对随机选取的乙型肝炎患者100例和1例追踪治疗的乙肝患者的血清HBV DNA含量和外周血单个核细胞中HBV cccDNA的含量进行检测;对已确诊的慢性乙肝患者40例,肝硬化患者30例外周血单个核细胞中HBV cccDNA的含量进行检测。[结果]100例乙型肝炎患者中,HBVDNA含量<5×102copies/mL有57例,HBV cccDNA的含量均<5×102copies/mL;HBV DNA含量>5×102copies/mL有43例,HBV cccDNA的含量>5×102copies/mL有22例;HBV DNA含量>1×103copies/mL的患者有17例,在这些患者中HBV cccDNA的含量>5×102copies/mL者为13例,两者之间比例经χ2检验,差异无显著性意义,P>0.05;肝硬化患者HBV cccDNA阳性率(>5×102copies/mL)为67.7%,远远高于慢性乙肝患者的42.5%和随机乙肝人群的22.0%。各组间患者比例经χ2检验,差异有显著性意义,P<0.05。[结论]乙型肝炎患者进行外周血单个核细胞中HBV cccDNA的检测,对于抗病毒治疗效果的监测和预后判断都重要的临床意义。

乙型肝炎患者血清HBV cccDNA检测的临床意义

目的观察乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccD-NA)在血清中的分布特点及与HBV感染状态的联系,探讨HBV cccDNA与患者病情的轻重、HBV的复制指标(HBeAg、HBV DNA)的关系。方法分别采用PCR荧光分子信标、荧光定量PCR、酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测162例乙型肝炎患者外周血清中HBV cccDNA定量、HBV DNA定量和乙型肝炎病毒标志物。结果162例乙型肝炎患者,血清HBV cccDNA阳性率为48.15%(78/62)。HBV cccDNA阳性率在HBV DNA阳性患者中为60.94%(78/128),显著高于HBV DNA阴性者[0(0/34)](P<0.01);HBeAg阳性患者HBV cccDNA检出率为61.70%(58/94),显著高于HBeAg阴性者29.04%(20/68)(P<0.01);中、重度慢性乙肝患者HBV cccDNA检出率为58.97%,高于轻度慢性乙型肝炎患者(45.45%)(P<0.05)。重型肝炎患者HBV cccDNA阳性者存活率(37.5%)明显低于HBV cccDNA阴性者(78.26%)(P<0.05)。结论HBV cccDNA仅存在于血清HBV DNA阳性乙型肝炎患者外周血清中;HBV cccDNA检出率与外周血HBV复制指标(HBeAg、HBV DNA)有显著的相关性,并与肝细胞炎症相关,是乙型肝炎病毒在患者体内大量复制及肝细胞损伤的血清标志。

乙肝患者血清HBV cccDNA的临床意义

目的:探讨血清HBVcccDNA与肝组织HBVcccDNA、血清HBVDNA的关系及临床意义。方法:采用荧光定量PCR(FQ-PCR),对69例乙肝携带者、慢乙肝、乙肝肝硬化及肝癌血清及15例肝组织的HBVcccDNA、HBVDNA进行检测,化学发光免疫分析定量检测血清HBsAg。结果:(1)肝组织HBVcccDNA阳性检出率为86.7%,高于血清HBVcccDNA阳性检出率(66.7%,P<0.05);(2)血清中HBVcccDNA与肝组织HBVcccDNA水平呈正相关(r=0.72,P<0.05);(3)血清HBVcccDNA拷贝数随HBVDNA水平升高而增大,且两者水平呈正相关(r=0.82,P<0.05);且HBVDNA高水平组(HBVDNA≥105copies/mL)的血清HBVcccDNA的阳性检出率(96.6%)高于低水平组(103copies/mL≤HBVDNA<1×105copies/mL)(67.5%)(P<0.05);(4)血清HBVcccDNA检出率随着病程进展而升高,在乙肝携带者、慢乙肝、乙肝肝硬化及肝癌中检出率分别为33.3%、83.3%、87.0%、87.5%,具有显著差异(P<0.05)。结论:血清HBVcccDNA可间接反映患者肝组织内HBVcccDNA情况,且与血清HBV复制指标HBVDNA显著相关;并与乙肝不同病程有关。

慢性HBV感染患者血清cccDNA与HBVDNA、HBeAg关系研究

目的研究慢性HBV感染患者血清cccDNA与HBVDNA、HBeAg关系。方法采用分子信标PCR技术检测156例慢性HBV感染患者血清cccDNA。结果血清HBVDNA、HBeAg阳性组的血清cccDNA阳性率分别与阴性组相比较差异有显著性(P<0.01),血清HBVDNA阴性组血清cccDNA阳性率为0,与HBeAg阴性组比较差异也有显著性(P<0.01)。HBeAg阳性组血清cccDNA水平较高,与阴性组比较差异有显著性(P<0.01)。结论血清cccDNA与血清HBVDNA、HBeAg密切相关,是判断HBV病毒复制、活动、抗病毒效果的指标,可能比HBeAg更有价值。

血清中HBV cccDNA定量检测方法的建立及临床应用

目的建立一种以TaqMan为探针检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的实时定量PCR检测方法。方法根据rcDNA与cccDNA结构差异,在缺口两侧设计引物,应用TaqMan探针分析,对实时PCR产物进行克隆、测序以证实产物为目的片段;同时对89例符合病毒性乙型肝炎诊断标准的血清样本进行HBVcccDNA和HBV DNA含量检测,3例未感染乙肝病毒的血清作为阴性对照。结果测序结果显示扩增产物为目的片段,检出下限为500 copies/mL;89例样本检测HBV cccDNA的阳性率为55.0%,HBeAg阳性患者阳性率为67.8%,HBeAb阳性患者阳性率为30.0%,HBeAg阳性的样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb阳性的样本(P<0.05),阴性对照组未检测出HBV cccDNA。应用ROC曲线图评价HBV cccDNA在抗病毒治疗中的价值,其价值为0.927。结论以TaqMan为探针检测血清HBV cccDNA的实时PCR检测方法,具有快速、敏感、特异性高等特点,应用该方法检测HBV cccDNA含量可作为判断临床抗病毒治疗效果的重要参考指标,指导临床用药。

应用巢式-实时定量PCR方法检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）是HBV复制的原始模板，是HBV持续感染的关键因素。外周血单核细胞（PBMc）中HBV cccDNA的存在状态及动态变化成为研究HBV肝外分布及复制问题的热点。诸多研究证实，PBMC中存在HBVDNA，但是否存在HBV复制模板HBV cccDNA及复制过程，却有不同意见。

环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)

目的建立一种检测石蜡包埋的肝组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探讨其应用价值和临床意义。方法提取30例慢性HBV感染患者的石蜡包埋肝组织中的DNA,采用质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),将检测结果与临床实验室资料结合并进行分析,以判断其临床应用价值。结果 30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA阳性,阳性检测率56.67%。其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻-中度)3例。提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,与血清HBV cccDNA阳性有一定的相关性,与乙型肝炎病毒血清免疫标志物以及肝功能状况无明显相关。结论 LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义。

慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA定量检测与基因型的相关性分析

目的探讨广东博罗地区慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA定量检测及其与患者的基因型的相关性。方法对305例患者进行随机分为4组,保证各组之间具有可比性,并对各HBV cccDNA含量的高低并没有明显的相关关系。结果研究为慢性乙型肝炎患者的诊治提供了参考,具有重要的临床意组患者的基因型和肝组织中HBV cccDNA含量进行测定,并分析其相关性。结论表明慢性乙型肝炎患者的HBV基因型和HBV cccDNA含量差异无统计学意义。

鸭肝组织中DHBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立基于DHBV病毒正、负链缺口区设计引物、沉淀蛋白结合的DNA、酶切消化残留线性DNA的DHBVcccDNA荧光定量PCR方法.方法 根据DHBV cccDNA和rcDNA结构的不同,将引物设计在DHBV DNA负链缺口的两侧.采用十二烷基硫酸钾蛋白质沉淀法分离肝组织中cccDNA和rcDNA.并对提取的DNA进行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,计算PSAD的用量,酶切消化残存的线性DNA.以pBR322/2DHBV Core重组质粒为PCR标准品,通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV cccDNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察和实际应用.结果 优化的PCR扩增产物电泳后可见239 bp的DNA片段,与目标片段长度相同.标准曲线回归方程Y=-4.085 7X＋48.805,R2=-0.997 6.方法的灵敏度为103 copies/ml,线性范围可达103～108 copies/ml.方法特异性强,未检出DHV,HBV及E coli DNA.对已感染DHBV的鸭肝组织检测DHBV cccDNA,进行定量,含量从0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分布最广的是10～99 copies/dioploid genome.DHBV cccDNA占总DHBV DNA的比例平均仅为3.86％,范围从0.01％～13.3s％.结论 根据DHBV cccDNA与rcDNA的结构和理化性质的差异,设计能够特异性扩增DHBV cccDNA的荧光定量PCR方法,方法灵敏度高、特异度强,可广泛应用于DHBV和HBV抗病毒治疗策略的相关研究中.

肝脏各段肝细胞内HBV cccDNA和HBV tDNA水平分布

HBV感染宿主肝细胞后,HBV基因组进入肝细胞先生产HBV cccDNA。然后以HBV cccDNA为模板转录装载成HBV rcDNA释放入血,对HBV的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义[1]。国内很多文献报道,慢性乙型肝炎病情和乙型肝炎相关性肝癌的发生均与HBV DNA的复制有关,