靶向HBV cccDNA形成的部分药物研究进展

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是全球重要的公共卫生问题。现有的抗HBV药物,即核苷(酸)类似物(NAs)和干扰素(IFN)类药物,虽可有效抑制HBV复制,但无法彻底清除感染肝细胞内稳定存在的共价闭合环状DNA(cccDNA),患者难以实现完全治愈。本文简要综述近年来直接靶向HBV cccDNA形成的部分药物研究进展,为实现乙型肝炎治愈提供可能。

靶向cccDNA以实现慢性乙型肝炎治愈

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的重要公共问题,约有2.96亿慢性感染者。HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)以微染色体的形式稳定存在于被感染的肝细胞核内,难以被现有的抗病毒药物靶向清除,因此被认为是HBV感染慢性化的关键因素。为实现慢性乙型肝炎(CHB)的临床治愈甚至完全治愈,我们迫切需要针对cccDNA的治疗策略。我们总结了目前cccDNA形成和调控的相关机制,并讨论通过靶向cccDNA以实现乙型肝炎治愈的可能策略。

PBMC中HBV cccDNA与HBV宫内感染关系的研究

目的 :对外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)中乙型肝炎病毒 (HBV)共价闭合环状DNA (covalentlyclosedcircularDNA ,cccDNA)进行扩增 ,并对其产物直接测序鉴定 ,以证实PBMC为HBV肝外复制的场所 ,从而进一步证实PBMC感染为乙型肝炎宫内感染的途径之一。方法 :选择性PCR扩增PBMC中HBVcccDNA ,并对 1例阳性产物直接测序鉴定 ,测序结果与GeneBank中已知序列进行同源性比较。结果 :HBsAg阳性孕妇PBMCHBVcccDNA的检出率为 9 .93% ,新生儿PBMCHBVcccDNA的检出率为 4 . 5 8% ,PBMCHBVcccDNA与公布的已知序列的同源性为 10 0 %。结论 :PBMC为HBV肝外复制的场所 ,PBMC感染很可能是乙肝宫内感染的传播机制之一。

乙型肝炎患者抗病毒治疗过程中肝组织HBV cccDNA与血清学标志物变化的动态变化研究

目的探讨慢性乙型病毒性肝炎患者抗病毒治疗过程中肝组织乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)与相关血清学标志物变化。方法 88例乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性的慢性乙型病毒性肝炎患者给予恩替卡韦抗病毒治疗96周。分别于0、24周、48周、96周检测肝组织中和血清HBV cccDNA、血清HBV DNA、乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)、HBeAg定量,并分析肝组织HBV cccDNA与血清学标志物变化的关系。结果与基线比较,治疗后24周时患者肝组织HBV cccDNA,血清HBV cccDNA,血清HBV DNA和HBs Ag均显著降低(P<0.05或P<0.01);治疗后24周和48周比较:肝组织HBV cccDNA,血清HBV cccDNA,血清HBV DNA差异有统计学意义(P<0.01);48周与96周检测指标相比:肝组织HBV cccDNA定量差异无统计学意义(P>0.05);血清HBV DNA定量和血清HBV cccDNA定量差异有统计学意义(P<0.01)。血清HBs Ag和HBeAg差异无统计学意义(P>0.05)。结论血清HBV DNA定量和血清HBV cccDNA定量同步下降幅度大于肝组织cccDNA定量和HBs Ag、HBeAg定量,肝组织HBV cccDNA定量、HBs Ag、HBeAg定量在48周后逐步趋于稳定。血清HBs Ag、HBeAg定量与肝组织HBV cccDNA具有较高的一致性,血清HBs Ag、HBeAg定量检测能更准确、方便、快捷指导临床诊断。

慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA定量与病情的相关性分析

目的探讨肝组织HBV cccDNA定量对慢性乙型肝炎(乙肝)患者病情的影响。方法应用FQ-PRC法检测42例乙肝患者肝组织HBV cccDNA、肝组织和血清HBV-DNA水平,同时对肝组织行常规病理染色判断肝组织炎症及纤维化程度;SP法检测肝组织中HBsAg、HBcAg表达,化学发光法检测HBV标志物。分析肝组织HBVcccDNA与组织和血清HBV-DNA、肝细胞内HBsAg、HBcAg水平及肝脏炎症、纤维化程度的关系。结果肝组织HBV cccDNA定量与组织及血清HBV-DNA定量呈正相关(r=0.807,P<0.001;r=0.627,P<0.001);与肝组织炎症活动度及纤维化程度无明显相关性;肝组织HBV cccDNA定量与肝细胞内HBsAg表达无明显相关性,而与HB-cAg表达呈正相关(r=0.486,P<0.05)。结论检测肝组织内HBV cccDNA可更精确反映HBV复制程度;对乙肝诊断、抗病毒治疗及选择停药时机具有重要价值。肝组织HBV cccDNA与血清HBV-DNA定量及HBcAg联合检测可指导抗病毒治疗。

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV cccDNA预测拉米夫定的治疗效果

目的:探讨慢性乙型肝炎拉米夫定治疗结束时,外周血单个核细胞(PBMC)中HBV cccDNA(乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA)检测对拉米夫定持续应答的预测作用. 方法:对慢性乙型肝炎患者17例进行拉米夫定治疗48 wk,获得完全或部分疗效(血清HBV DNA转阴, ALT复常,伴或不伴HBeAg血清转换),48 wk治疗结束时检测PBMC中HBV cccDNA,并对患者进行1 a的血清HBVDNA监测. 结果:治疗结束时PBMC中HBV cccDNA为阳性9例, 阴性8例.在PBMC中HBV cccDNA阳性者,停止治疗的1 a内所有患者的血清HBVDNA阳转.而PBMC中HBV cccDNA阴性者,1例血清HBVDNA阳转. 结论:拉米夫定治疗结束时PBMC中HBV cccDNA的检测可能对拉米夫定治疗能否获得持续应答具有预测价值.

乙型肝炎病毒感染相关性肝癌中HBV cccDNA水平与突变关系的研究

目的:研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染相关性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,ccc DNA)水平与突变关系。方法:运用特异性荧光定量PCR定量分析了12例肝癌组织和癌旁组织中乙肝病毒复制水平的表征因子HBV ccc DNA,HBV total DNA及前基因组RNA(pregenome RNA,pg RNA)的表达水平,再用滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)特异性扩增癌组织中HBV ccc DNA,测序分析了病毒基因组4个编码调控区域pre C/C、RT、X、pre S中ccc DNA序列的突变。最后检测了肿瘤组织ccc DNA的AP位点。结果:HBV ccc DNA在癌组织的表达水平明显低于癌旁组织(3.32 copies/cell vs.9.64 copies/cell,P=0.029),但是HBV总DNA和pg RNA的表达没有明显差异(16.94 copies/cell vs.12.18 copies/cell,P=0.325,75.54 copies/cell vs.22.46 copies/cell,P=0.128);在肝癌组织中,HBV ccc DNA pre C/C和X区间,G-A突变是主要的突变类型;其次,pre C/C和X区域发生G-A突变的位置上,均更倾向于GA二联核苷酸组合方式,在肝癌中所占比例为37.1%和40%。最后,肿瘤组织中APE1酶处理后,HBV ccc DNA水平明显下降(1 011 copies/μl vs.501.8 copies/μl,P=0.058)。结论:HBV ccc DNA水平在癌组织中明显低于癌旁组织,可能与癌组织中HBV ccc DNA发生大量GA突变及形成的AP位点有关。

乙型肝炎病毒cccDNA检测与血清学及病理诊断关系

目的建立和应用聚合酶链反应法(PCR),检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA),探讨慢性乙型肝炎肝组织HBV cccDNA与乙型肝炎的血清学及病理关系。方法分别采用PCR法检测慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA,同时用免疫组化法检测肝细胞中HBcAg、Pres1;荧光定量PCR法检测慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA载量;电发光化学方法检测慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒标志物。分析肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA载量、HBeAg、HBeAb,以及肝细胞内HBcAg、Pres1的关系。结果①127例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA载量呈正相关(P<0.01)。②127例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA阳性组与HBV cccDNA阴性组血清HBV DNA载量及肝细胞内HBcAg、Pres1无显著性差异(P>0.05)。③HBV cccDNA阳性组的HBeAg检出率明显高于HBV cccDNA阴性组,HBV cccDNA阴性组的HBeAb检出率明显高于HBV cccDNA阳性组。结论测定肝组织中HBV cccDNA,对于了解乙肝患者病情和传染性强弱以及评价肝脏炎症活动度有重要意义。

水芹总酚酸对2.2.15细胞HBV DNA、cccDNA的抑制作用

目的观察水芹总酚酸对2.2.15细胞HBV-DNA、cccDNA的抑制作用。方法药物稀释成500、250、125 mg.L-1加入2.2.15细胞进行培养,每4 d换含同浓度药物培养液;分别收集d 4、8以及停药后4 d的细胞,试剂盒提取HBV-DNA、cccDNA,荧光定量PCR(FQ-PCR)测定其含量,观察水芹总酚酸对其抑制作用。结果水芹总酚酸对HBV-DNA和cccDNA都具有很好的抑制作用,在细胞培养的d 8其高、中剂量(500、250 mg.L-1)的抑制作用达到最大:HBV-DNA为62.3%和47.7%,cccDNA为62.7%和61.3%,且在停药后3 d仍保持较高的抑制率(P<0.05)。结论水芹总酚酸可以有效的抑制2.2.15细胞HBV-DNA、cccDNA的表达,抗病毒作用明显,且无明显的停药反跳现象。

乙型肝炎病毒cccDNA定量与乙型肝炎临床及病理关系

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)肝组织HBVcccDNA定量与乙型肝炎的关系。方法分别采用荧光定量PCR、酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测48例CHB肝组织HBV cccDNA定量、肝组织和血清HBV DNA定量、乙型肝炎病毒标志物。同时用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法(SP)检测肝细胞中HBcAg表达。分析肝组织HBV cccDNA与组织和血清HBV DNA、HBeAg、肝细胞内HBcAg水平及肝脏炎症活动度的关系。结果1.肝组织HBV cccDNA定量与组织和血清HBV DNA定量呈正相关(r=0.837,P<0.001;r=0.627,P<0.005);2.肝组织HBV cccDNA定量与肝细胞内HBcAg半定量呈正相关(r=0.618,P<0.005);3.肝组织HBV cccDNA定量与肝脏炎症活动度无明显相关(P>0.05):4.HBeAg阳性较抗-HBe阳性患者肝组织HBV cccDNA定量、肝组织和血清HBV DNA定量高(P<0.05)。结论荧光定量PCR法检测肝组织HBV cccDNA定量是评价HBV复制最直接可靠的指标,在CHB的诊断和抗病毒治疗中有重要意义。但与肝组织炎症无明显相关。

人工肝支持系统对重型乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA影响的初步研究

目的:建立HBV cccDNA荧光定量PCR方法并检测重型乙型肝炎患者人工肝血浆置换治疗前后血清中HBVcccDNA含量。初步探索人工肝支持系统对重型乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA的影响。方法:以50例重型乙型肝炎患者人工肝血浆置换治疗前后血清作为检测标本,对血清中总HBV DNA、HBV cccDNA含量进行定量检测。用SAS8.0统计软件对结果进行统计学分析。结果:成功建立定量检测HBV cccDNA方法并证实在重型乙型肝炎患者血清中存在HBV cccDNA。在人工肝血浆置换前后总HBV DNA及HBV cccDNA含量明显降低(P<0.05)。总HBV DNA与HBV cccDNA之间有较好的相关性(r=0.78,P<0.01)。总HBV DNA水平与PT(r=0.37,P<0.01)、ALT(r=0.29,P<0.05)、AST(r=0.39,P<0.01)水平有一定的相关性;HBV cccDNA水平与PT(r=0.34,P<0.05)、ALT(r=0.34,P<0.05)、AST(r=0.40,P<0.01)水平有一定的相关性。结论:总HBV DNA及HBV cccDNA在一定程度上能够反映肝细胞坏死程度;血浆置换术后病毒含量明显降低,为进一步研究重型乙型肝炎治疗途径及发病机制打下基础。

醌氧化还原酶1抑制剂双香豆素促进HBV X蛋白降解进而抑制cccDNA转录的机制研究

【据Journal of Hepatology2021年3月报道】题:醌氧化还原酶1抑制剂双香豆素促进HBV X蛋白降解进而抑制ccc DNA转录的机制研究(作者Cheng ST等)HBV ccc DNA在肝细胞核内持续稳定的存在,被认为是HBV感染慢性化、抗病毒治疗无法彻底清除以及停药后肝炎复发的最主要原因。HBV X蛋白(HBx)对HBV ccc DNA的转录过程发挥关键作用;促进HBx降解,则可能抑制ccc DNA转录。因此,开发靶向HBx的小分子化合物是达到"ccc DNA沉默清除"这一重要目标的可能途径。

乙型肝炎患者外周血单个核细胞HBV cccDNA含量的检测及其临床意义

[目的]采用实时荧光定量PCR的方法检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV cccDNA的含量,并探讨其临床意义。[方法]应用实时荧光PCR(RT-PCR)方法对随机选取的乙型肝炎患者100例和1例追踪治疗的乙肝患者的血清HBV DNA含量和外周血单个核细胞中HBV cccDNA的含量进行检测;对已确诊的慢性乙肝患者40例,肝硬化患者30例外周血单个核细胞中HBV cccDNA的含量进行检测。[结果]100例乙型肝炎患者中,HBVDNA含量<5×102copies/mL有57例,HBV cccDNA的含量均<5×102copies/mL;HBV DNA含量>5×102copies/mL有43例,HBV cccDNA的含量>5×102copies/mL有22例;HBV DNA含量>1×103copies/mL的患者有17例,在这些患者中HBV cccDNA的含量>5×102copies/mL者为13例,两者之间比例经χ2检验,差异无显著性意义,P>0.05;肝硬化患者HBV cccDNA阳性率(>5×102copies/mL)为67.7%,远远高于慢性乙肝患者的42.5%和随机乙肝人群的22.0%。各组间患者比例经χ2检验,差异有显著性意义,P<0.05。[结论]乙型肝炎患者进行外周血单个核细胞中HBV cccDNA的检测,对于抗病毒治疗效果的监测和预后判断都重要的临床意义。

乙肝患者血清HBV cccDNA的临床意义

目的:探讨血清HBVcccDNA与肝组织HBVcccDNA、血清HBVDNA的关系及临床意义。方法:采用荧光定量PCR(FQ-PCR),对69例乙肝携带者、慢乙肝、乙肝肝硬化及肝癌血清及15例肝组织的HBVcccDNA、HBVDNA进行检测,化学发光免疫分析定量检测血清HBsAg。结果:(1)肝组织HBVcccDNA阳性检出率为86.7%,高于血清HBVcccDNA阳性检出率(66.7%,P<0.05);(2)血清中HBVcccDNA与肝组织HBVcccDNA水平呈正相关(r=0.72,P<0.05);(3)血清HBVcccDNA拷贝数随HBVDNA水平升高而增大,且两者水平呈正相关(r=0.82,P<0.05);且HBVDNA高水平组(HBVDNA≥105copies/mL)的血清HBVcccDNA的阳性检出率(96.6%)高于低水平组(103copies/mL≤HBVDNA<1×105copies/mL)(67.5%)(P<0.05);(4)血清HBVcccDNA检出率随着病程进展而升高,在乙肝携带者、慢乙肝、乙肝肝硬化及肝癌中检出率分别为33.3%、83.3%、87.0%、87.5%,具有显著差异(P<0.05)。结论:血清HBVcccDNA可间接反映患者肝组织内HBVcccDNA情况,且与血清HBV复制指标HBVDNA显著相关;并与乙肝不同病程有关。

乙型肝炎患者血清HBV cccDNA检测的临床意义

目的观察乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccD-NA)在血清中的分布特点及与HBV感染状态的联系,探讨HBV cccDNA与患者病情的轻重、HBV的复制指标(HBeAg、HBV DNA)的关系。方法分别采用PCR荧光分子信标、荧光定量PCR、酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测162例乙型肝炎患者外周血清中HBV cccDNA定量、HBV DNA定量和乙型肝炎病毒标志物。结果162例乙型肝炎患者,血清HBV cccDNA阳性率为48.15%(78/62)。HBV cccDNA阳性率在HBV DNA阳性患者中为60.94%(78/128),显著高于HBV DNA阴性者[0(0/34)](P<0.01);HBeAg阳性患者HBV cccDNA检出率为61.70%(58/94),显著高于HBeAg阴性者29.04%(20/68)(P<0.01);中、重度慢性乙肝患者HBV cccDNA检出率为58.97%,高于轻度慢性乙型肝炎患者(45.45%)(P<0.05)。重型肝炎患者HBV cccDNA阳性者存活率(37.5%)明显低于HBV cccDNA阴性者(78.26%)(P<0.05)。结论HBV cccDNA仅存在于血清HBV DNA阳性乙型肝炎患者外周血清中;HBV cccDNA检出率与外周血HBV复制指标(HBeAg、HBV DNA)有显著的相关性,并与肝细胞炎症相关,是乙型肝炎病毒在患者体内大量复制及肝细胞损伤的血清标志。

慢性HBV感染患者血清cccDNA与HBVDNA、HBeAg关系研究

目的研究慢性HBV感染患者血清cccDNA与HBVDNA、HBeAg关系。方法采用分子信标PCR技术检测156例慢性HBV感染患者血清cccDNA。结果血清HBVDNA、HBeAg阳性组的血清cccDNA阳性率分别与阴性组相比较差异有显著性(P<0.01),血清HBVDNA阴性组血清cccDNA阳性率为0,与HBeAg阴性组比较差异也有显著性(P<0.01)。HBeAg阳性组血清cccDNA水平较高,与阴性组比较差异有显著性(P<0.01)。结论血清cccDNA与血清HBVDNA、HBeAg密切相关,是判断HBV病毒复制、活动、抗病毒效果的指标,可能比HBeAg更有价值。