美洲南瓜CCR基因表达特点的研究

采用qRT-PCR方法对2种(有壳和裸仁)美洲南瓜的胚珠、授粉后10～60d的种皮以及叶片、茎秆、柱头等组织中CCR基因表达进行了分析。结果显示:(1)从胚珠到授粉后60d,2种美洲南瓜种皮中CCR基因的表达量均呈增加-降低-增加-再降低的趋势,且不同时间(天)CCR基因的表达量存在显著或极显著差异。(2)2种美洲南瓜胚珠中CCR基因的表达量存在差异但不显著,裸仁美洲南瓜CCR基因的表达量为有壳美洲南瓜的1.2倍。(3)随授粉后时间的延长,有壳美洲南瓜种皮中CCR基因的表达量逐渐高于裸仁美洲南瓜,在授粉后10～60d时,有壳美洲南瓜种皮中CCR基因的表达量均显著或极显著大于裸仁美洲南瓜,且分别为裸仁美洲南瓜的1.2～5.1倍。研究表明,CCR基因参与美洲南瓜种皮发育与形成,CCR基因在裸仁美洲南瓜叶片、茎秆、柱头等组织中的表达量均大于有壳美洲南瓜,且同一品种、不同组织中CCR基因的表达量存在组织特异性,表达量与组织木质化的程度呈正相关。

木质素生物合成酶CCR基因的生物信息学分析

肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是催化木质素特异途径的第一个关键酶,是调节碳素流向木质素潜在的控制关节点,对木质素单体的生物合成起着重要作用。通过NCBI数据库收集来自裸子植物、单子叶植物及双子叶植物的35条CCR基因的完整信息,对35条CCR基因的cDNA及其编码的氨基酸序列的进化规律、理化性质、结构域、导肽、信号肽、跨膜结构域、亲/疏水性以及蛋白质结构等性状进行了生物信息学分析与预测,构建了CCR基因的系统发育树。分析结果表明,单子叶植物CCR基因中GC的含量明显高于双子叶植物;CCR基因编码的氨基酸序列存在9个保守区域;所编码氨基酸的理化性质基本一致,但单子叶、双子叶及裸子植物的CCR基因编码主要氨基酸的种类和含量存在着差异;CCR蛋白的N-端存在一个脱氢酶/差向异构酶/辅酶Ⅰ结合蛋白的结构域,无导肽、信号肽及跨膜结构域,属亲水性蛋白;进化树绘制以及同源建模结果表明,CCR基因的进化和植物的进化基本一致,CCR蛋白三级结构模型的空间结构稳定,建模结果可靠。分析结果对于深入研究CCR蛋白在木质素合成中的作用具有一定的理论指导意义。

杯果木CCR基因克隆和同源进化分析

从粗毛杯果木和软叶杯果木基因组中克隆CCR基因,经测序验证扩增片断长度均为2321bp,包含部分外显子3、4和部分5,以及内含子3和4。同源性比较分析表明:粗毛杯果木与伞房属树种CCR的同源相似性达到98%～87%,与桉属树种CCR的同源相似性达到97%～84%;而软叶杯果木与伞房属树种CCR的同源相似性达到98%～87%,与桉属树种CCR的同源相似性达到95%～84%。总体上,该2个杯果木树种与伞房属CCR同源相似性较高,而与桉属CCR同源相似性较低。3个属中最长保守序列位于Exon5的第3147～3175位点,共29个碱基。保守区域主要集中于Exon5,少数于Intron4。桉属总变异率大于杯果木属和伞房属。桉属Exon4变异率大于属内其它Exon或Intron;同样发现Exon4的简约信息位点百分数大于属内其它Exon或Intron,但杯果木属中的Intron3变异率高于属内其它Exon或Intron。伞房属以Exon5的变异率最高。Exon或Intron平均变异率均以桉属最多,其次是杯果木属,最少的是伞房属。使用MEGA3.1软件构建的CCR进化树表明,桉属、伞房属和杯果木属分别形成单系,其亲缘关系可以明显区分开来。杯果木属最早产生分歧,并形成单独一个分枝;其次是伞房属,也形成单独一个分枝,进化较杯果木属迟;最迟进化的是桉属,也形成单独一个分枝。这种结果与形态学比较接近,易为人们所接受。

象草PpCCR基因正、反义表达载体的构建及对烟草的转化

象草(Pennisetum purpureum)是一种广泛种植于热带和亚热带地区的多年生资源植物,但其木质素含量过高,影响了对其的开发与利用。为探讨肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-Co A Reductase,CCR)基因对木质素合成的影响,本研究以华南象草为材料,构建了CCR基因正反义表达载体,并利用农杆菌侵染法转化烟草。通过Wiesner和Maule染色法对转基因植株进行木质素的组织化学染色。结果发现,转基因植株的木质素单体组成并没有明显改变;但Pp CCR过表达烟草,转基因株系木质化细胞增多;Pp CCR反义表达烟草,转基因株系木质化细胞排列相对松散。同时反义表达CCR,在木质素含量下降最明显的植株中茎秆呈红褐色。上述结果表明,CCR对木质素的合成起重要作用,这为进一步对象草进行遗传改良奠定了基础。

MRSA SCCmecⅢ型ccr基因在抗生素压力下的差异表达

目的分析不同种类、不同浓度抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)染色体mec盒(SCCmec)Ⅲ型ccr基因表达的影响。方法将临床分离株MRSA 62分别在不含抗生素及含有氨苄西林、替考拉宁、万古霉素和利奈唑胺的培养基中培养,每种抗生素分别设立20μg/ml(高),2μg/ml(中)和0.2μg/ml(低)3种浓度。提取细菌总RNA,采用Real-time PCR检测MRSA ccrA、ccrB、ccrC基因表达水平。结果在中等浓度的氨苄西林中MRSA 62ccrA、ccrB、ccrC基因高表达。高浓度的万古霉素可杀死细菌,而低浓度万古霉素能诱导ccrA、ccrB、ccrC基因高表达。高浓度的替考拉宁能杀死细菌,而中等浓度时诱导ccrA、ccrB、ccrC基因高表达。中等浓度利奈唑胺ccrA、ccrB、ccrC基因高表达。结论不同种类及浓度抗生素压力对MRSA SCCmecⅢ型ccr基因表达水平的影响不同,ccr基因的表达直接影响到耐药基因的整合与剪切表达水平,这可能是MRSA SCCmecⅢ型对抗生素耐药的机制之一。

应用TALEN技术对兔CCR5基因进行靶向修饰

缺少合适的能够被人免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus 1,HIV-1）感染的动物模型是获得性免疫缺陷综合征/艾滋病（Acquired immunedeficiency syndrome,AIDS）疫苗和药物研发的瓶颈.HIV-1能在野生型兔子中形成持续感染,在共表达人CD4和CCR5的兔细胞系中,HIV-1能高效复制,并形成合胞体.若在家兔中高表达人CD4和CCR5,就可能获得研究AIDS的理想动物模型.文章采用高效基因打靶技术—类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）,探讨在家兔CCR5基因位点定点敲入人CD4和CCR5,获得能够感染HIV-1家兔模型的可能性.针对家兔CCR5基因,设计了两对TALENs和一个同源打靶载体,TALEN mRNAs和DNA同源片段显微注射到家兔受精卵中,体外培养3～5 d后,收集24枚胚胎,对胚胎的基因突变情况进行PCR和测序分析.结果显示,在家兔CCR5位点,24枚胚胎均发生了基因敲除,5枚胚胎还发生了人CD4和CCR5基因敲入.该结果为建立艾滋病研究新动物模型奠定了基础.

中国人CCR5732基因突变的检测及其对HIV遗传易感性的初步评估

为了解ＣＣＲ５Δ３２ 基因突变在中国本土人群基因组中的分布，初步评估我国人群对ＨＩＶ－１ 感染的遗传易感性，用ＰＣＲ扩增、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交和ＤＮＡ 测序等分子生物学方法对９１５ 名中国人来源的基因组ＤＮＡ中ＣＣＲ５Δ３２ 基因突变进行了检测。结果发现，所有被检测的个体绝大多数均表现为ＣＣＲ５ ｗ ｔ／ｗ ｔ纯合子等位基因型，仅检测到两例个体为突变的杂合子ＣＣＲ５ｗ ｔ／Δ３２ 基因型，而未见到有突变的ＣＣＲ５Δ３２／Δ３２ 纯合子的个体。上述初步结果提示：在我国人群中，ＣＣＲ５Δ３２ 基因突变率很低（约为０．２％ ），所以我国绝大多数人群对ＮＳＩ嗜巨噬细胞的ＨＩＶ－１

人CCR5Delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建

目的:克隆人CCR5Delta32基因并构建含目的基因的重组慢病毒载体pLenti-CCR5Delta32,用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究.方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序.再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析.结果:经PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与GenBank上的序列完全一致,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中.结论:成功克隆了人CCR5Delta32基因并构建了含目的基因的重组慢病毒载体pLenti-CCR5Delta32,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础.

中国人HIV-1感染相关的基因CCR5多态性检测和不同方法提取的基因组DNA的比较

目的 检测中国人基因组中HIV-1感染相关的特异性协同受体(CCR5)的基因多态性和比较提取人基因组DNA方法的优缺点。方法 我们分别用常规法和柱层析法从1219名中国人外周血PBMC中提取基因组DNA样品,对纯化后的DNA样品质量进行定性和定量分析;并对其基因组DNA中CCR5基因进行了PCR、Southern杂交和直接DNA测序等分析。结果 在中国人基因组中,检测的CCR5基因多态性是wt/wt 1 210例、wt/△32 3例,未检测到CCR5△32/△32纯合子突变,CCR5等位基因突变率为0.125％。常规法提取的基因组DNA所需的外周静脉血多(5ml);DNA的量较少且不稳定;操作步骤复杂。相反,QIAamp Boold Kit柱层析法提取DNA仅需要外周血200μl,可稳定地获得一定量的DNA,操作简便。结论 首次报道了中国人CCR5等位基因突变率是0.125％,提示我国绝大多数人群对嗜巨细胞HIV-1病毒的遗传易感性较高;同时证实试剂盒法提取的DNA更适合于CCR5基因多态性分析。

小鼠β趋化因子受体CCR_5基因的克隆

目的：克隆小鼠β趋化因子相关的受体并研究其表达。方法：使用共同引物用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔巨噬细胞的Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ中扩增出一０．５ｋｂｃＤＮＡ，再根据其序列，设计一特异引物，用ＭａｒａｔｈｏｎＰＣＲ法扩增得一２．８ｋｂｃＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ方法检测分析该基因，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ方法分析其表达。结果：成功克隆出小鼠ＣＣＲ５ｃＤＮＡ，其开放阅读框为１０６５ｂｐ，编码３５５个氨基酸，与人巨噬细胞炎性趋化蛋白５受体（ｈｕＭＩＰ－５Ｒ）同源性为８１％，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ结果显示该基因为单拷贝，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ结果显示小鼠巨噬细胞、脾脏等有表达。结论：克隆得到小鼠ＣＣＲ５基因，可作为研究ＨＩＶ－１感染机制及ＡＩＤＳ治疗有价值的实验模型。

马尾松肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)克隆及分析(英文)

对马尾松肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)进行扩增、克隆和测序(GenBank登录号:EU753854)。应用MEGA4.0.2软件对不同树种CCR基因的核苷酸和氨基酸序列进行比对,结果表明:马尾松CCR基因的外显子和内含子数目与火炬松、杨树、银合欢、光皮桦、冈尼桉、柳桉、蓝桉的外显子和内含子数目相同,都有5个外显子和4个内含子。马尾松CCR基因编码区975bp,编码324个氨基酸。马尾松外显子Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,V分别为133,155,186,353,148bp,而内含子Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ分别为1450,216,737,941bp。马尾松CCR外显子和内含子连接处序列除内含子Ⅱ/外显子Ⅲ出现GTPuGG/外显子Ⅲ,其余遵循外显子/GTPuAG/外显子组成规律。马尾松外显子Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ核苷酸数目与桉属、杨属、桦木属和松属树种相同,但外显子Ⅰ和外显子Ⅴ不尽相同。比对的树种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上相对保守,也存在一定差异。马尾松与火炬松、光皮桦、银合欢、杨树、冈尼桉、柳桉、蓝桉各物种间编码区核苷酸序列相似性大小分别为99.2%,67.8%,68.0%,68.9%,69.5%,69.3%,69.9%,而相应的氨基酸序列间相似性大小分别为99.1%,73.5%,72.5%,74.4%,75.0%,74.4%,75.0%。马尾松与其他13个树种CCR序列构建的系统进化树表明:3个针叶树种形成1个独立分支,而且最早进化。

广西壮族人群HIV协同受体CCR5基因突变的检测

目的了解广西壮族人群中HIV协同受体CCR5△32等位基因突变频率和多态性的特点,为评估广西壮族人群对HIV的遗传易感性和艾滋病的防治提供理论依据。方法以152例壮族大学生为研究对象,应用PCR和DNA直接测序等方法检测CCR5及CCR5△32突变体。结果未发现CCR5△32等位基因。结论由于未发现CCR5△32,推测广西壮族人群对HIV-1病毒感染可能具有较大的遗传易感性。

表达CCR5Delta32基因对人外周血单核细胞增殖功能的影响

目的:在人外周血单核细胞(PBMC)内表达CCR5Delta32基因,研究是否对该细胞增殖功能产生影响。方法:构建pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒,将其转染PBMC,荧光显微镜观察转染情况,Westernblot鉴定目的蛋白的表达;分别用植物血凝素(PHA)及破伤风类毒素(TTD)刺激培养经转染的靶细胞,采用MTT比色法测定其增殖功能是否受影响。结果:构建了pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,经包装后产生重组慢病毒,滴度约为5×105TU/mL。将其转染PBMC,观察到约半数PBMC胞浆内有绿色荧光蛋白表达,经Westernblot进一步鉴定为目的蛋白;转染的靶细胞经PHA或TTD刺激培养后,有着与正常PBMC相似的增殖功能。结论:构建了重组慢病毒并将其转染PBMC靶细胞,为获得性免疫缺陷综合征的基因治疗研究奠定了基础。

CCR2和CCR5基因多态性与结核性脓胸的关系

目的探讨CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A单核苷酸多态性(SNP)与结核性脓胸的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对结核性脓胸患者300例和健康对照组300例进行CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A SNPs检测。结果与CCR2基因-190 GG基因型相比,携带AG和AA基因型均可增加结核性脓胸发病风险(OR=2.254,95%CI 1.043~4.868;OR=8.728,95%CI 4.224~18.033)。进行分层分析发现,无卡介苗(BCG)接种史、体质量指数(BMI)<18.5 kg/m^2均增加结核性脓胸发病风险(OR=3.309,95%CI 2.108~4.382;OR=2.767,95%CI 1.918~3.993)。CCR5基因-59029 G/A各基因型未入选回归方程,无统计学意义(P>0.05)。结论CCR2基因-190 G/A SNP可能与结核性脓胸的发病风险有关;CCR5基因-59029 G/A SNP可能与结核性脓胸无关。

含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装及滴度测定

目的:包装含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒并测定其滴度,用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMC)中提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRⅠ单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序;将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析;用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32等4种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并测定其滴度。结果:克隆出人CCR5Delta32基因,并构建了含该基因的重组慢病毒载体,经293T细胞包装后产生5×105 TU/mL的重组慢病毒。结论:高滴度含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装,为进一步的AIDS基因治疗研究奠定了基础。

兔CCR9基因的克隆与序列分析

设计1对克隆引物,从兔十二指肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coliJM109感受态细胞,检测阳性克隆、测序并进行序列分析。结果表明:克隆的兔CCR9基因长为624 bp,编码由208个氨基酸残基组成的CCR9前体蛋白,预测CCR9具有多个跨膜区。克隆的兔CCR9基因与绵羊、人的同源性分别为82.9%、82.7%;推导的兔CCR9氨基酸序列与绵羊、人的同源性分别为80.1%、82.2%,其结构特征与绵羊、人的相一致。

灵长类CCR5基因的序列进化与系统发育研究

对白颊长臂猿和白臀叶猴的β－趋化因子受体ＣＣＲ５基因进行全序列测定，并与人、黑猩猩、大猩猩，恒河猴，食蟹猴，豚尾猴，阿拉伯狒狒的ＣＣＲ５基因序列进行比较后发现，这些灵长类的ＣＣＲ５基因序列之间以及蛋白质序列之间具有很高的相似性。采用ＰＡＵＰ３．１．１（简约法）和ＭＥＧＡ１．０２（ＮＪ法）对ＤＮＡ序列数据进行聚类分析，得到了这几种灵长类的分子系统树。两种方法得到的分枝结构完全一致。

CCR5基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的 :研究CCR5基因 5′侧翼区的调控序列。方法 :分段构建CCR5基因 5′侧翼区的pCAT报告基因载体 ;分析各片段在Hela细胞中的CAT调节活性。结果 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4 86bp序列的pCAT重组质粒在Hela细胞中能明显表现CAT上调活性 ,其活性比pCATenhancervector的活性高 3倍。结论 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4

人CCR7基因真核表达载体构建及表达

目的构建人CCR7基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达,为其临床应用奠定基础。方法以RT-PCR法从临床肺腺癌标本中扩增出CCR7编码区序列,定向克隆至载体pEGFP-N1中构建质粒pEGFP-CCR7,采用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒DNA导入肺腺癌A549细胞中,加入G418对细胞进行筛选获得稳定表达CCR7的细胞,并用流式细胞仪对重组质粒的表达进行鉴定。结果PCR、酶切及测序结果证明重组质粒pEGFP-CCR7构建正确,荧光显微镜及流式细胞术在稳定转染A549细胞中检测到人CCR7的表达。结论人CCR7基因真核表达质粒已成功构建并稳定转染肺癌A549细胞株;本研究为临床应用提供了实验依据。