慢病毒载体介导CDK2基因沉默对黑素瘤B16-F1细胞生物学行为的影响

目的:探讨由慢病毒载体p UL介导的p UL-CDK2-shRNA3(CDK2-shRNA)沉默CDK2基因后对小鼠黑素瘤B16-F1细胞恶性生物学行为的影响,初步探索其作用机制。方法:利用重组慢病毒载体CDK2-shRNA转染B16-F1细胞,MTT法检测其对细胞增殖的影响,DAPI染色、Annexin V-FITC/PI双染流式术检测细胞凋亡情况,流式术检测细胞周期变化,细胞黏附实验、transwell小室实验分别检测细胞黏附、侵袭和迁移能力变化,Western blotting检测细胞周期信号通路上RB蛋白(成视网膜细胞瘤蛋白)、pRB蛋白、细胞周期相关转录因子E2F1及侵袭迁移相关蛋白基质金属酶-2(MMP-2)、基质金属酶-9(MMP-9)的表达水平。结果:与空白对照组和阴性对照组相比,CDK2-shRNA组细胞相对增殖率、细胞黏附率、细胞侵袭和迁移能力均显著下降(均P<0.05)。细胞凋亡率显著增加(均P<0.05);G1期细胞显著增加而S期和G2期显著降低(P<0.05)。细胞周期相关蛋白pRB、E2F1明显降低而RB显著升高(P<0.05),细胞侵袭和迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9明显降低(P<0.05)。结论:慢病毒载体p UL介导的shRNA沉默CDK2基因对B16-F1细胞恶性生物学行为有显著的抑制作用,其机制主要与细胞周期和细胞侵袭迁移相关蛋白表达变化有关。

内蒙古绒山羊CDK2基因的克隆与序列分析

采用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,首次从内蒙古绒山羊睾丸组织中克隆出羊CDK2基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为EF035041)。结果显示:羊CDK2基因的cDNA序列长为1 355 bp,5′端非翻译区为174 bp,3′端非翻译区为266 bp,开放阅读框为894 bp,编码298个氨基酸。与牛CDK2基因cDNA序列同源性为98%,氨基酸序列完全一致;和其他哺乳动物CDK2基因的cDNA序列同源性也达92%以上;氨基酸序列同源性为93%以上。说明CDK2在结构和功能上有很高的保守性。

乳腺癌MCF-7细胞的增殖及周期与CDK2-AP1基因的表达的相关性研究

目的探讨乳腺癌MCF-7细胞的增殖及周期与CDK2-AP1基因的表达的相关性研究,为临床乳腺癌的分子治疗提供基础。方法取我院研究所保存的人乳腺癌细胞MCF-7进行培养,并构建CDK2-AP1基因编码的病毒表达载体,应用实时定量PCR验证CDK2-AP1基因mRNA和蛋白的表达率。利用流式细胞仪检测MCF-7细胞周期的改变。结果过表达CDK2-AP1基因的慢病毒感染MCF-7细胞可上调其mRNA表达6.87倍。MCF-7细胞过表达CDK2-AP1基因后,增殖能力显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测证实MCF-7细胞过表达CDK2-AP1能够使细胞周期出现G1期阻滞。结论 CDK2-AP1基因具有抑癌基因的功能,在乳腺癌MCF-7细胞过表达该基因能够抑制细胞的生长和克隆形成能力,并且使细胞阻滞于G1期。

胃癌中p16基因表达、缺失及突变的检测

目的:研究p16基因表达与胃癌发生发展、侵袭、转移的关系及p16基因外显子2缺失、突变在胃癌发生中的地位。方法:运用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶SP免疫组织化学方法检测胃癌及癌前病变组织中p16蛋白的表达;采用聚合酶链反应PCR、聚合酶链反应-单链构象多态性PCRSSCP分析方法检测胃癌中p16基因外显子2的缺失、突变。结果:1p16蛋白表达阳性率:①正常胃粘膜96.25%77/80,不典型增生92.00%45/50,胃癌47.54%58/122,胃癌组中p16蛋白表达低于正常胃粘膜及不典型增生(P<0.05);②粘液腺癌10.00%,1/10低于低分化腺癌51.22%,21/41、未分化癌57.69%,15/26和印戒细胞癌62.50%,10/16(P<0.05);③30例原发癌和淋巴结转移癌配对标本中p16蛋白表达阳性率:原发癌46.67%(14/30),淋巴结转移癌16.67%5/30,淋巴结转移癌低于原发癌P<0.05;2p16基因缺失与突变分析:25例胃癌中检测出缺失5例但未发现突变。结论:①p16蛋白表达缺失与胃癌的发生、组织学类型及淋巴结转移有关。②p16基因外显子2缺失可能与胃癌发生有关而p16基因突变可能与胃癌发生无关。