斑节对虾cdc25基因的表达分析

在已构建的斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组cDNA文库中筛选了cdc25基因的EST序列,使用实时荧光定量PCR获得了cdc25基因在雌性个体不同组织及卵巢不同发育阶段的表达情况。结果表明:cdc25基因在雌性个体的卵巢、淋巴、脑神经、血、肌肉、心脏、鳃、肝胰腺和肠9种组织中均有表达,并存在显著性差异,其中心脏的相对表达量最高。同时,cdc25基因在卵巢发育6个时期的时序表达结果显示,cdc25基因在卵巢中的相对表达量在Ⅰ期最大,与其他5期存在显著差异,而后骤降,直到Ⅴ期才稍微升高,随后又逐渐降低。

RNAi沉默CDC25a基因对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的影响

目的:研究细胞分裂周期素25a(cell division cycle 25a,CDC25a)基因RNAi(RNA干扰)的重组慢病毒载体对人肝癌细胞Hep G2 CDC25a基因表达和裸鼠移植瘤生长的影响。方法:实验组以CDC25a基因重组慢病毒颗粒感染Hep G2细胞;阴性对照组以RNAi-NC慢病毒颗粒感染Hep G2细胞;空白对照组常规培养。三组细胞分别接种至裸鼠皮下,建立人肝癌裸鼠移植瘤模型。连续28 d观察裸鼠成瘤情况及移植瘤生长情况,28 d后测定肿瘤体积和重量。用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学法检测移植瘤中CDC25a的表达情况。结果 :各组裸鼠接种Hep G2细胞后第7天均有肿瘤形成,实验组的肿瘤生长速度、体积和重量明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。实验组瘤体中CDC25a的m RNA及蛋白表达与阴性对照组及空白对照组相比明显下降(P<0.05)。结论:LV-CDC25a-RNAi重组体沉默Hep G2细胞的CDC25a基因后能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,提示CDC25a基因可被认为是肝癌治疗的关键靶点。

RNA干扰技术沉默CDC25a基因对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

目的:研究细胞分裂周期素25a(cell division cycle 25a,CDC25a)基因沉默后对于人肝癌细胞系Hep G2增殖的影响。同时探讨该影响发生的可能作用机制。方法:使用RNA干扰技术沉默人肝癌Hep G2细胞的CDC25a基因,采用实时荧光定量PCR技术检测肝癌细胞中的CDC25a及其作用基因cyclin E及CDK2的mRNA表达水平,Western blotting检测CDC25a的蛋白表达水平,并采用MTT法、Giemsa染色法及流式细胞技术检测细胞的增殖情况。结果:CDC25a的mRNA及蛋白表达水平在RNA沉默组细胞中的表达低于阴性对照组及正常对照组细胞(P<0.05)。Cyclin E及CDK2的mRNA表达水平在沉默组低于阴性对照及正常对照组(P<0.05)。MTT法、Giemsa染色法结果显示沉默组细胞增殖能力低于阴性对照组及正常对照组细胞(P<0.05),流式细胞技术结果显示沉默组细胞阻滞在G1期。结论:LV-CDC25a-RNAi重组体感染Hep G2细胞可以有效抑制CDC25a基因的表达,使人肝癌Hep G2细胞增殖受到抑制,提示CDC25a基因可能是肝癌治疗的关键靶点。

小鼠卵母细胞wee 1和cdc25 mRNART-PCR方法的建立

在没有现成的哺乳动物卵母细胞 wee l、cdc 2 5m RNA的 RT-PCR方法可借鉴的情况下 ,经过反复摸索 ,终于选出了 1对适宜的 wee l c DNA引物和 1对 cdc2 5c DNA引物 ,并对 RT-PCR条件进行了优化试验 ,成功地建立起了一套稳定的 wee l、cdc2 5m RNA的 RT-PCR方法 ,为研究哺乳动物卵母细胞 。

RT-PCR检测CDC25B基因在大肠肿瘤中的转录表达

为了解CDC25B基因mRNA在大肠癌、不同阶段大肠腺瘤及正常粘膜中的表达,探讨CDC25B在大肠癌发生、发展中的作用,采用RT-PCR方法,检测24例大肠癌组织,62例大肠腺瘤及10例正常大肠粘膜中CDC25B基因的表达。结果表明:①CDC25B在大肠癌、大肠腺瘤中的表达率明显高于正常组织,差异有显著意义(P<0.05)。前二者之间差异无显著性(P>0.05)。在大肠腺瘤伴有轻、中、重度不典型增生的病例中,表达阳性率有逐渐增高趋势,但未达到有显著意义的程度(P>0.05)。②CDC25B在大肠癌、大肠腺瘤中的相对含量与正常组织中的差异均有非常显著意义(P<0.01),前二者之间差异亦有显著意义(P<0.05);同时腺瘤伴有轻、中、重度不典型增生组织中CDC25BmRNA含量有逐渐增高趋势,三者差异有非常显著意义(P<0.01)。上述结果提示,CDC25B参与了大肠腺瘤到大肠癌的转变过程,在大肠癌的发生中起一定作用,其在大肠腺瘤中的表达程度对了解腺瘤到癌转变的危险性具有指导意义。

人GST-Cdc25C融合蛋白的原核表达、纯化及功能初步检测

目的:构建人Cdc25C基因原核表达载体,获得纯化的GST-Cdc25C融合蛋白,并对其功能进行初步检测。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增Cdc25C基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Ros-sate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot方法检测融合蛋白表达,通过GSTpull-down技术检测纯化蛋白与已知结合蛋白Chk2的相互作用。结果:构建得到Cdc25C基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为80 000的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达,并纯化得到GST-Cdc25C融合蛋白,GST pull-down检测证实GST-Cdc25C蛋白可以和已知相互作用蛋白Chk2相互作用。结论:成功克隆Cdc25C基因,并获得了活性良好的GST-Cdc25C蛋白,为进一步研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。

胃癌组织中CyclinD1、CDC25B的表达变化及意义

目的观察胃癌组织中Cyclin D1、CDC25B mRNA及蛋白的表达变化,并探讨其意义。方法收集手术切除胃癌组织标本42例份,同时取距肿瘤边缘>5 cm处作为正常黏膜组织。采用RT-PCR法检测胃癌及正常胃黏膜组织中Cyclin D1、CDC25B mRNA表达,采用Western blotting法检测胃癌及正常胃黏膜组织中Cyclin D1、CDC25B蛋白表达,分析Cyclin D1、CDC25B表达与胃癌患者临床病理特征的关系。结果 Cyclin D1、CDC25B mRNA及蛋白在正常胃黏膜组织中的相对表达量均显著低于胃癌组织(P均<0.05),Cyclin D1、CDC25B蛋白表达与胃癌淋巴结转移有关(P均<0.05),胃癌组织中Cyclin D1、CDC25B蛋白表达呈正相关(r=0.513,P<0.05)。结论胃癌组织中Cyclin D1、CDC25B呈高表达,且与胃癌淋巴结转移有关;检测二者水平有助于胃癌预后判断。

CDC25B1对人胰腺癌细胞株Patu8988的生物学行为的影响

目的探讨CDC25B1基因在人胰腺癌细胞株Patu8988中的表达情况,并将真核表达重组载体pcDNA-CDC25B1转染至细胞中,观察CDC25B1基因对细胞生物学行为的影响,以了解它在细胞周期及胰腺肿瘤细胞恶性转化方面的作用,为研究胰腺癌的发病机制与治疗提供理论依据。方法利用Lipofectamine2000将CDC25B1转染至人胰腺癌细胞株Patu8988中,通过RT-PCR和Westernblot在mRNA和蛋白水平验证质粒转染成功,通过MTT实验、侵袭实验和细胞周期检测,观察CDC25B1对细胞生物学行为的影响。结果RT-PCR发现在胰腺癌细胞株Patu8988和转染空质粒的细胞株中,CDC25B1在mRNA水平表达很弱;转染pcDNA-CDC25B1组中CDC25B1高表达。Westernblot发现在胰腺癌细胞株Patu8988中,CDC25B蛋白有少量表达;转染pcDNA-CDC25B1组CDC25B蛋白高表达。MTT实验显示,转染pcDNA-CDC25B1组的细胞生长在72h受到明显抑制(P(0.05)。侵袭实验显示,转染pcDNA-CDC25B1的细胞其穿透Matrigel胶的能力明显增强(P(0.05)。流式细胞计量术显示,转染了pcDNA-CDC25B1组中,G1期的细胞明显增多(P(0.05);同时转染了pcDNA-CDC25B1组中,G2期的细胞明显减少,与未处理组比较有统计学意义(P(0.05)。结论在胰腺癌细胞株Patu8988中的CDC25B1转录水平很弱,存在少量CDC25B蛋白表达。转染的CDC25B1基因提高CDC25B1蛋白的表达,使细胞停滞在G1期,对细胞的生长有抑制作用,但能够增强细胞的侵袭能力;CDC25B1可能不是通过单一的调控细胞周期而实现其对细胞的影响,还存在其它多种途径。

CDC25B基因在胰腺癌组织中的表达

近年来发现CDC25B基因是一种潜在的癌基因，在许多肿瘤的发生和发展中起到重要作用，但在胰腺癌中的表达和作用机制尚不明确。本研究旨在检测胰腺癌和正常胰腺组织中CDC25B基因的表达情况，探讨CDC25B基因在胰腺癌发病机制中的作用。

人Cdc25B基因启动子报告基因载体的构建及转录活性分析

目的构建人细胞分裂周期25家族蛋白B(Cdc25B)基因启动子(promoter)荧光素酶报告基因载体p GL3-Cdc25B-promoter,并检测其转录活性。方法应用欧洲启动子在线数据库(EPD)获得人Cdc25B基因5'端非编码区处包含转录起始位点在内的-2000^+100的DNA序列。以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,并插入到p GL3-Basic荧光素酶报告基因载体上。通过设计不同引物,进一步构建系列缺失体,共获得7个不同长度启动子序列的报告基因载体。将其与内参质粒pRL-TK瞬时共转染He La细胞,通过双荧光素酶报告基因活性测定实验检测不同缺失体的转录活性。利用定点突变及RNA干扰(RNAi)探究预测的转录因子对Cdc25B转录活性的影响。结果构建的人Cdc25B基因启动子荧光素酶报告基因载体p GL3-Cdc25B-promoter经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转染He La细胞后,检测到荧光素酶高表达(P<0.05)。启动子系列缺失分析显示-160^-53片段包含基本核心启动子,与生物信息学的预测结果一致。定点突变及RNA干扰显示NF-YB转录因子对Cdc25B起正调控作用。结论成功构建了7个具有转录活性的人Cdc25B启动子缺失片段,确定了NF-YB是Cdc25B转录的一个重要调控因子,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础。

CDC25B基因在肝细胞肝癌的表达

目的探讨CDC25B基因在肝细胞肝癌（HCC）组织中的表达，以探讨其在HCC发生和发展中的作用。方法联合应用激光显微切割和实时定量PCR技术检测24例正常肝脏组织和24例HCC组织中CDC25B基因的表达，PCR产物的定量方法采用比较Ct法；应用Western blot检测其蛋白的表达水平；应用免疫组织化学方法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PC—NA）的表达。结果在显微镜下用激光显微切割机，将单个肝细胞成功切下，提取RNA后，逆转录成cDNA，实时定量PCR发现CDC25B基因平均模板量在正常肝脏组织中为0．0006350±0．00021，HCC组织中为0．001988±0．00065，上调约3倍（P〈0．01）。CDC25B mRNA的表达与PCNA明显相关（r=0．45，P〈0．05）。HCC组织中CDC25B蛋白也过度表达，正常肝脏组织CDC25B蛋白表达为1．02±0．43，HCC组织为6．01±1．66，上调约6倍（P〈0．01）。结论CDC25B在HCC组织中表达明显上调，该基因的高表达与细胞周期调节机制的关系以及在HCC细胞的恶性转化中的作用还有待进一步探讨。

新西兰兔Cdc25C基因Hin1Ⅰ酶切多态性研究

本试验采用PCR产物直接测序法寻找家兔细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(Cdc25C)基因SNPs位点,并用PCR-RFLP分型技术对新西兰兔共174个个体进行遗传多态性分析。结果表明,在家兔Cdc25C基因编码区1296bp处发生同义突变(c.1296 T>C),该突变位于Cdc25C蛋白的RHOD(rhodanese)结构域,TT基因型为优势等位基因型(0.6437),T等位基因为优势等位基因(0.7874)。遗传分析表明,c.1296 T>C位点在新西兰兔中的杂合度(He)为0.3348,有效等位基因数(Ne)为1.5033,多态信息含量(PIC)为0.2788,表现为中度多态(0.25<PIC<0.50),表明该位点有较高的遗传变异,选择潜力较大。

Galectin-3与CDC25B在胃癌中的表达及意义

目的探讨半乳糖凝集素3mRNA（Galectin-3）和细胞分裂周期蛋白25BmRNA（celldivisioncycle25B，CDC25B）在胃癌中的表达及其与临床病理参数及预后的关系。方法应用组织微阵列技术和原位杂交法检测220例胃癌组织和31份正常胃黏膜组织中Galectin3mRNA和CDC25BmRNA的表达情况。结果220例胃癌中Galectin3tuRNA和CDC25BtuRNA的阳性表达率分别为58．6％、54．1％；Galectin-3mRNA表达与肿瘤大小、TNM（tumor，lymphnode，metastasis）分期、浸润深度、脉管侵犯、淋巴结转移及远处转移呈正相关；CDC25BmRNA表达也与肿瘤大小、TNM分期、脉管侵犯、淋巴结转移及远处转移呈正相关；Galectin3mRNA表达与CDC25BmRNA表达呈正相关；Galectin-3mRNA和CDC25BmRNA阳性表达病例的平均生存时间和5年生存率均明显低于阴性表达的病例。结论Galectin3和CDC25B基因的表达促进了胃癌的发生和发展，是指导临床治疗及评估预后的有效指标。

微小RNA-148a对胃癌细胞MKN45增殖能力的影响及机制研究

目的：探讨微小RNA（miR）-148a对人胃癌细胞增殖的影响及可能机制。方法采用实时定量PCR技术检测60例胃癌组织及癌旁组织中miR-148a的表达水平。利用慢病毒包装建立稳定表达miR-148a的MKN45细胞系为转染组，未转染的MKN45细胞系为对照组。 CCK8法检测MKN45细胞的增殖情况，通过targetscan预测miR-148a的靶基因，Western-blot检测靶基因的表达水平。结果54例（90．0％，54/60）胃癌组织中miR-148a的表达量较癌旁组织下调，其中37例（61．7％，37/60）下降2倍以上；淋巴结转移、有无癌旁血管浸润及TNM分期Ⅲ～Ⅴ期者其表达量明显降低（P＜0．05）。转染miR-148a后3 d，MKN45细胞生长明显受抑，转染组吸光度值（0．978±0．091）明显低于对照组（1．182±0．074，P＝0．000）。转染组CDC25B（通过targetscan发现的miR-148a靶基因）蛋白表达较对照组明显降低。结论 miR-148a在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织；其具有抑制胃癌细胞增殖的作用，CDC25B可能是miR-148a发挥抑癌作用的靶基因。

微小RNA-429在人胃癌前病变组织的表达

目的探讨微小RNA（miRNA，miR）-429在人胃癌前病变中的表达及其作用。方法采用实时定量聚合酶链反应（PCR）技术检测50例胃癌组织、60例慢性萎缩性胃炎组织以及60例正常胃组织中miR-429表达水平；采用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导人胃黏膜上皮细胞株（GES-1）转化成胃癌前病变（PLGC）细胞模型，利用包装好的miR-429慢病毒以及慢病毒阴性对照感染PLGC细胞，细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测PLGC细胞的增殖，通过Targetscan预测miR-429的靶基因，Western blot检测靶基因的表达水平。结果54例（90.0%，54/60）慢性萎缩性胃炎组织中miR-429的表达量较正常胃组织下调，其中37例（61.7%，37/60）下降2倍以上，伴有肠上皮化生、不典型增生者表达量降低更为显著（P＝0.012）。所有胃癌组织中miR-429的表达量均低于正常胃组织及慢性萎缩性胃炎组织（均P＝0.003），且与肿瘤有无淋巴结转移、癌旁血管浸润及TNM分期呈负相关。转染miR-429后5 d，PLGC细胞生长明显受抑，转染组吸光度值（0.852±0.023）明显低于对照组（1.488±0.031，P＝0.000）。转染组CDC25B（通过Targetscan发现的miR-429靶基因）蛋白表达较对照组明显降低。结论miR-429在慢性萎缩性胃炎组织、胃癌组织中表达均明显低于正常胃组织，具有抑制胃癌前病变发展、影响胃癌侵袭转移的作用。