农杆菌法将抗菌肽D基因导入蕉柑胚性细胞的研究

用农杆菌介导的方法成功地将抗菌肽D基因导入到蕉柑胚性悬浮细胞 .再生芽经PCR、Southern杂交证明抗菌肽D基因已整合到其基因组DNA中 .在农杆菌介导的蕉柑胚性悬浮细胞转化过程中 ,共培养介质中的乙酰丁香酮 (As)能显著提高其转化效率 ,与对照相比 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数从 0提高到 0 .75 .悬浮细胞与农杆菌共培养时间对转化效率也具有显著影响 ,共培养 1、2、3d后 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数分别为 0 .2 0、0 75、0 .

转抗菌肽D烟草对土壤微生物群落的影响

采用RAPD分子标记技术研究了种植转抗菌肽D烟草的土壤环境中微生物群落遗传多样性的变化,同时用传统平板培养法研究了土壤中可培养微生物在数量上的变化。RAPD分析结果表明,转抗菌肽D烟草与非转基因烟草根围微生物的遗传多样性相关指数并没有显著差异。培养计数结果表明,转抗菌肽D烟草与非转基因烟草根围可培养细菌在数量上有极显著差异,可培养真菌数量有显著减少,可培养放线菌的数量没有显著差异。说明转抗菌肽D烟草可能抑制了病原细菌及其根围相关的微生物,但是不影响微生物的遗传多样性。

几丁质酶和抗菌肽D双价基因转化茄子的研究

在建立茄子的组织培养及遗传转化体系的基础上，以根癌农杆菌为介导，采用叶盘法将几丁质酶和抗菌肽Ｄ双价基因转入茄子，分别获得６株ＫａｎＲ植株。对ＫａｎＲ植株进行点杂交、ＰＣＲ扩增等分子检测。结果表明，目的基因已整合进茄子核基因组中。

转柞蚕抗菌肽D基因辣椒的目的基因及表达产物检测

应用现代生物技术,从核酸和蛋白质水平对转柞蚕抗菌肽D基因辣椒第4代的目的基因进行了检测。发现所分离的柞蚕抗菌肽D基因与原设计的序列一样;辣椒组织中也含有抑菌物质,经与天然抗菌肽D对比,表明抗菌肽D基因得到了表达。

柞蚕抗菌肽D基因转化广藿香的研究

结果表明，柞蚕抗菌肽Ｄ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ－Ｄ）对广藿香青枯病的病原细菌ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＳｏｌａｎａｃｅｒｕｍ有很强的抑制作用。通过农杆菌介导的方法将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ－Ｄ基因导入广蕾香细胞，获得５株转基因植株，并繁殖成无性系。５个无性系在与病原菌共培养时都表现出一定的抗性。

人工会成柞蚕杀菌肽D基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以质粒pWR450为载体,克隆了人工合成的柞蚕杀菌肽D基因(122bp),构建的重组子pWR450-Cec转化大肠杆菌JM103、用限制性内切酶酶切鉴定。产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示可表达杀菌肽-β-gal融合蛋白。

双价抗菌肽基因表达载体的构建

将人工合成的抗菌肽Ｄ基因和抗菌肽Ｂ基因克隆到同一植物表达载体ｐＢⅠ１２１，且各自具有其３５ｓ启动子和Ｎｏｓ终止子。先将抗菌肽Ｄ基因及其启动子和终止子克隆到ｐＢ１２１ＨｉｎｄⅢ位点获得ｐＥＣＶⅠ重组子。然后将抗菌肽Ｂ基因克隆到ｐＥＣＶⅠ的ＢａｍＨⅠ位点，经Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ检测和酶切鉴定获得具有抗菌肽Ｄ，抗菌肽Ｂ基因的双价基因表达载体ｐＥＣＶⅡ。

双抗植物表达载体的构建

用限制性内切酶将抗虫的胰蛋白酶抑制剂（ＴＩ）基因从质粒ｐＢｉｎ２０上切下，插入带有抗细菌的抗菌肽Ｂ和抗菌肽Ｄ基因的植物表达载体ｐＤＢ３的ＸｂａⅠ位点。通过点杂交和酶切鉴定，得到了带有３个抗性基因的双抗植物表达载体ｐＤＢＴ．