RNAi技术降低头孢菌素C工业生产菌株中cefG基因的转录

RNAi是近年来新兴的一种通过抑制基因转录水平来实现特定基因表达沉默的技术。本研究尝试在顶头孢霉工业生产菌株中利用RNAi技术沉默cefG基因的转录,构建了一个含可形成cefG双链RNA转录单元的质粒,并将其导入头孢菌素C工业生产菌株中。结果发现其中两个转化子的cefG基因转录水平在发酵第4天较出发菌株降低了80%以上,而它们的头孢菌素C发酵水平较出发菌株则分别降低了34.6%和28.8%。

顶头孢霉cefG基因的表达及抗体制备的研究

通过PCR方法得到带酶切位点的cefG基因,用于构建表达质粒pET30-G,并在大肠杆菌里成功表达出乙酰转移酶的包涵体。将该重组蛋白的标准品作为抗原,免疫BALB/c小鼠得到多克隆抗体,酶联免疫吸附测定(ELISA)分析得抗体的效价满足实验需求。利用该抗体绘制出抗原浓度的标准曲线,确定待测抗原适合的检测浓度在0.16μg/mL以下。制得的抗体在重组大肠杆菌里检测到了乙酰转移酶,证明所得抗体具有实验价值。

利用CRISPR/Cas9系统构建低DCPC杂质含量的CPC工业高产菌种

以头孢菌素C(CPC)工业生产菌株顶头孢霉1-D1为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术降低杂质脱乙酰头孢菌素C(DCPC)累积,提高CPC产量与质量。首先,构建了CPC乙酰水解酶敲除菌株Ac-ΔcahB以期减少CPC水解。然后通过导入含cefG基因表达盒的Donor DNA,构建Ac-ΔcahB::cefG菌株以期提高DCPC转化效率。通过摇瓶发酵验证表明Ac-ΔcahB效价没有提高但杂质含量略有下降,而Ac-ΔcahB::cefG不仅产量比对照提高约32.6%,达6072μg/mL,而且DCPC杂质含量(DCPC峰面积/CPC峰面积)显著降低到6.81%。从cefG转录水平来看,Ac-ΔcahB::cefG菌株在96 h转录量提高了5倍。可以发现,cefG基因在强启动子PgpdA作用下可提高表达量,促进DCPC转化,从而提高CPC产量。此外,在工业顶头孢霉中,结合Donor DNA共同作用的CRISPR/Cas9系统是一个更为高效的基因编辑方法。