血清浓度对高原体外肝细胞培养的影响

目的了解在高原环境条件下血清对培养肝细胞生长的影响,初步确定进行体外肝细胞培养的适宜血清浓度。方法采用已适应本地环境的成年家兔肝细胞进行体外单层培养,在常规RPMI1640培养基的基础上添加不同浓度的新生牛血清(0%、2%、10%及20%),观察培养细胞形态、数量及培养上清中白蛋白和尿素水平变化。结果无血清组始终未见明显细胞贴壁及增殖,其他组细胞均于接种4 h开始贴壁,8 h开始增殖,10%血清组和20%血清组细胞均于6 d生长满瓶,并形成均匀的单层,而2%血清组细胞则于8 d生长满瓶;2%血清组的细胞数量峰值明显低于10%血清组和20%血清组;除无血清组外,培养上清中白蛋白和尿素水平均呈现显著升高,其中10%血清组和20%血清组的白蛋白及尿素峰值水平明显高于2%血清组。结论在高原环境条件下,体外培养肝细胞的生长、增殖及其生物学功能维持明显依赖于常规基础培养基中添加的血清浓度;对于普通肝细胞培养实验而言,10%血清浓度较为适宜。

高原现场体外动物细胞培养的实验研究

目的:初步探索在高原现场进行体外动物细胞培养的可行性。方法:采用成年家兔肝细胞进行体外原代培养,观察细胞形态及培养上清中ALB和AFP水平变化。结果:细胞接种4 h开始贴壁,8 h开始增殖,胞内核数目增多,6 d已生长满瓶;培养上清中ALB及AFP水平均呈现显著升高,其达峰值时间分别为8 d和6 d。结论:体外培养肝细胞生长、增殖及其生物学功能良好,提示在本驻地海拔高度条件下能够进行体外动物细胞培养。

高原猪肝细胞生物反应器的生物学活性

目的了解在高原环境下,培养球形聚集体猪肝细胞中空纤维型生物反应器的生物学活性特征,为构建高原体外生物人工肝提供实验依据。方法采用已适应本地高原环境的长白仔猪,并分离其肝细胞,经体外球形聚集体培养2 d后,移入中空纤维型生物反应器外腔中,内腔以培养液循环,继续培养10 d,观察培养细胞形态,检测外腔培养液中的总蛋白、白蛋白、尿素和乳酸脱氢酶水平变化。结果经过2 d培养后,肝细胞形成了大量的结构较为稳定的球形聚集体;中空纤维反应器培养前,外腔培养液中总蛋白、白蛋白及尿素水平分别为（16.2±0.3）g/L、（5.9±0.3）g/L和（2.5±0.2）mmol/L,培养2 d后均呈现明显升高,差异有显著性（P〈0.05）,4 d达高峰,分别为（22.7±2.4）g/L（、7.8±0.4）g/L和（4.6±0.5）mmol/L,然后逐渐下降,培养8~10 d时明显低于4 d时水平;乳酸脱氢酶水平培养6 d时明显升高,差异有显著性（P〈0.05）,8~10 d时进一步升高,差异有显著性（P〈0.05）。结论在高原环境条件下,以培养球形聚集体猪肝细胞2~6 d时制备的中空纤维型生物反应器的生物学活性良好,为进一步应用于构建高原环境下生物人工肝奠定了基础。

高原实验动物(家兔)血液若干指标的观察与分析

本研究属“高红症——高原实验动物骨髓形态研究”的前期工作,通过对移居果洛大武地区(海拔3900米)不同时期的五组家兔外周血几项指标的观察分析,确定了红细胞数量增加的时间和组均值,其红细胞数量增长的高峰为6.71×10^(12)/L,发生时间在三周左右。另外结合同期所做的高原现场的三种土著啮齿动物的血液资料分析,提出家兔红细胞增多的下限值为7.3×10(12)/L。本文还对实验家兔的血红蛋白(Hb)含量、网织红细胞计数、红细胞比积值等进行了研究报道。

高原体外生物型人工肝装置的构建与初步评价

目的在高原环境条件下构建体外生物型人工肝装置,通过在线运行初步评价其安全性和稳定性,为应用于治疗急性肝衰竭实验研究提供依据。方法采用已适应本地环境的健康长白仔猪2头,雌雄不限,体质量分别为29.5 kg和31.0 kg。建立经颈外静脉至下腔静脉/颈外静脉插管组合血路,以驱动泵、血流管路、辅助加热器及含有培养肝细胞的生物反应器构建生物型人工肝装置,于体外血液循环中持续转流8 h,观察实验前后动物的一般状态、心率、血常规、尿常规及血液生物化学指标改变,有无出血倾向发生,血流管路凝血情况及培养肝细胞活性的变化。结果分离所得肝细胞量为2.72×109,肝细胞纯度为93%,肝细胞活率为96%。体外血液循环实验后,动物未出现明显不良反应,心率无显著改变,血常规、尿常规及血液生物化学指标均正常,未见出血倾向;血流管路凝血不明显;反应器内培养肝细胞活率,实验前后分别为(87.33±2.08)%和(84.67±3.79)%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论该方法构建的高原体外生物型人工肝装置较为稳定、可靠,动物耐受性好。

简易胶原酶消化法提取兔原代肝细胞及培养

目的探讨简易、经济的Ⅳ型胶原酶消化法提取分离新生兔原代肝细胞及体外培养。方法采用0.1%Ⅳ型胶原酶对新生兔肝脏组织小块进行消化以提取兔原代肝细胞,体外进行单层培养,并对提取的兔肝细胞的细胞数量、细胞活力和细胞增殖能力进行检测。结果提取的肝细胞主要呈类圆形,排列整齐,细胞透亮有光泽,立体感好,细胞界限清晰。1 g肝组织可分离1.12×10~6个肝细胞,成活率为77%。细胞增殖能力呈先升后降趋势,细胞生长曲线较符合原代细胞生长的一般规律。结论该实验方法简单、易操作,无需特殊设备,适合一般实验室开展原代肝细胞的提取、分离与培养。

低氧和中草药作用后的家兔肺泡Ⅲ型细胞电镜观察

肺泡Ⅱ型细胞是肺泡上皮中主要细胞之一。随着对其研究的逐渐深入,发现该细胞对正常肺脏功能行使起着举足轻重的作用。至于在高原低氧环境下,Ⅱ型细胞会发生哪些形态结构上的变化,已有人做过一些观察报道。但是,上述文献多属描述性观察报道,缺乏定量分析资料。我们的工作正是为了弥补这方面的不足,同时也为今后的形态定量分析积累一些参考数值,实验中除了观察记录之外,还测量分析了肺泡Ⅱ型细胞的七项指标。实验结果如下:高原实验动物的Ⅱ型细胞体确有增大,微绒毛减少,长度变短,线粒体数量增加(上述几项指标,P值均小于0.05)。另外还发现,抗缺氧药物——异叶青兰对低氧环境下Ⅱ型细胞的结构变化是有影响的,主要表现为,用药后的Ⅱ型细胞内板层体数量减少(P<0.05)。关于低氧和异叶青兰的作用机制还有待深入探讨。

高原环境体外猪肝细胞原代培养的初步研究

目的:初步了解在高原环境条件下体外培养猪肝细胞的生长、增殖与功能特征。方法:采用已适应本地环境的长白仔猪分离肝细胞并进行体外原代培养,观察细胞形态、细胞数量及培养上清中总蛋白、白蛋白和尿素水平变化。结果:细胞接种后4h开始贴壁,8h开始增殖,4d细胞数量明显增多,6d生长满瓶,培养上清中总蛋白、白蛋白和尿素水平均呈现显著升高。结论:体外培养猪肝细胞生长、增殖及其生物学功能良好,可以作为构建高原体外生物型人工肝脏的生物材料。

高原低氧和中草药作用后的家兔肺泡Ⅱ型细胞电镜观察

现代研究证实肺泡Ⅱ型细胞对于肺泡功能的正常行使起着至关重要的作用。关于在高原环境下,该细胞会发生那些形态结构的变化,已经有人做过一些观察报道。但是,上述文献多属定性分析资料,绝少较科学、准确的定量分析。我们的工作正是为了弥补这方面的不足,同时也为今后在高原医学领域开展形态计量研究,提供和积累一些参考数值。实验分析发现:高原环境确能引起肺泡Ⅱ型细胞体的增大,细胞游离面的微绒毛减少,长度变短,线粒体数量增加(上述几项指标的P值均小于0.05)。另外,中草药——异叶青兰对Ⅱ型细胞的影响也进行了对比研究。

高原体外肝细胞分离方法

目的 :探索高原环境下动物肝细胞的体外分离方法 ;方法 :采用胶原酶体外两步灌流法先进行肝叶灌流 ,再将所得肝组织悬液分别置 3 7℃温育不同时间 ,对比观测肝细胞产量、存活率、纯度及细胞接种后生长情况的差异 ;结果 :未经温育组及温育 1 0min、3 0min、60min组肝组织悬液的肝细胞产量分别为 ( 0 .85、2 .67、3 .84、4.2 9)× 1 0 6/ g湿重肝组织 ;肝细胞存活率分别为 97.6%、96.9%、88.3 %及 71 .5% ;肝细胞纯度分别为 96.2 %、95.4%、96.7%及 95.8% ;前两组细胞贴壁生长和增殖情况均较好 ,后两组则较差 ;结论 :在高原环境下先采用肝叶体外两步灌流后再行胶原酶短时间 ( 1 0min左右 )温育处理是一种既可获得较满意的细胞活性 ,同时又可显著提高细胞产量的分离肝细胞方法。

高原红细胞增多症患者骨髓间充质干细胞的培养

目的:对高原红细胞增多症(HAPC)患者骨髓间充质干细胞(MSCs)进行分离培养,为进一步探讨其生物学特性奠定基础。方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选法对10例HAPC和10例正常人骨髓MSCs进行分离培养,倒置显微镜下观察MSCs形态,流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,判断其增殖能力。结果:骨髓密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(BMMNC)后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34和HLA-DR(P>0.05)。HAPC骨髓MSCs增殖能力高于正常骨髓(P<0.01)。结论:HAPC患者骨髓MSCs体外可有效分离培养,所培养的细胞成分单一,可供进一步实验应用。