猪RegⅢγ蛋白的重组表达及功能研究

【目的】探究重组猪RegⅢγ蛋白的生物功能及相应分子机理,为该蛋白的开发应用提供参考。【方法】利用PCR扩增RegⅢγ基因片段,并连接至pDCP载体,以构建RegⅢγ蛋白重组表达系统。加入IPTG低温诱导促使重组蛋白高效表达,利用镍柱亲和层析纯化蛋白并进行透析后研究其对不同细菌的抑制作用,以及对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)的促增殖与损伤修复及抗氧化与凋亡的功能,进一步探究其分子机理。【结果】纯化后重组蛋白Western blotting鉴定结果显示,17 ku处存在特征条带,确定重组猪RegⅢγ蛋白成功表达。重组猪RegⅢγ蛋白对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌2种革兰阳性菌有明显的抑菌效果,MIC 90均为39.1μg/mL,对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌2种革兰阴性菌未产生抑菌圈;可促进IPEC-J2细胞的增殖及损伤修复,且浓度为10μg/mL时增殖与修复效果最佳。与对照组相比,表皮生长因子受体(EGFR)、细胞外调节蛋白激酶1(ERK1)、ERK 2、细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、CDK 4、细胞周期蛋白E(Cyclin E)和Cyclin D基因mRNA表达水平显著升高(P<0.05),而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)基因mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。将重组蛋白作用于氧化损伤IPEC-J2细胞时,与对照组相比,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著增强(P<0.01),丙二醛(MDA)含量(P<0.05)、乳酸脱氢酶(LDH)(P<0.01)活性均降低,并发现其通过降低促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bax基因的mRNA表达水平,提高抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达水平,发挥对氧化损伤IPEC-J2细胞的抗氧化与凋亡作用。【结论】重组猪RegⅢγ蛋白对革兰阳性菌有选择性抑制作用,对IPEC-J2细胞增殖与损伤修复均有促进作用,且具有一定抗氧化与凋亡作用。

人牙龈间充质干细胞条件培养液对人成纤维细胞生物学功能的影响

目的 观察人牙龈间充质干细胞条件培养液(GMSCs-CM)对人成纤维细胞生物学功能的影响。方法 制备GMSCs-CM,将0(空白对照组)、1、5、10、50、100μg/mL浓度的GMSCs-CM作用于成纤维细胞,采用CCK-8法检测成纤维细胞增殖情况,TUNEL法检测成纤维细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测在0(空白对照组)、1、10、100μg/mL浓度的GMSCs-CM作用下成纤维细胞的Ⅰ型胶原(COL-1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β(TGF-β)mRNA的表达。结果 GMSCs-CM能明显促进成纤维细胞的增殖。当GMSCs-CM浓度为1μg/mL时促进成纤维细胞增殖的作用最为显著,而对细胞凋亡无明显影响。与空白对照组比较,GMSCs-CM浓度为1μg/mL明显提高成纤维细胞COL-1、PCNA、TGF-β mRNA表达水平(均P<0.05)。结论 GMSCs-CM对成纤维细胞的增殖能力有明显的促进作用,而对细胞凋亡无明显影响,有望用于促进皮肤创面愈合治疗。

角质细胞生长因子2对细胞生长、移行及创伤愈合的作用

角质细胞生长因子2(KGF-2)是成纤维细胞生长因子超家族的一员,由间质细胞合成并分泌,能特异促进上皮细胞增殖、分化与迁移,对脊椎动物多种组织和器官的发育起重要调控作用.通过PCR从人的肾组织cDNA文库中克隆分离获得了KGF-2的cDNA,表明该因子在成人肾中有表达.采用大肠杆菌表达并纯化重组蛋白用于生物学功能研究的结果显示:KGF-2在体外不仅能够促进角质细胞的生长和增殖,而且对其凋亡具有抑制作用,还对细胞的移行具有影响.在动物实验中,KGF-2能促进皮肤切除产生的伤口愈合,提示该蛋白质可以作为创伤治疗或辅助用药的候选分子.

不同时期伤口渗出液对成纤维细胞的影响

伤口微环境的愈合状况．在一定程度上反映在伤口不同时期渗出液的质和量的变化。本文比较研究伤口不同天数渗出液对修复细胞的影响．探讨伤口微环境在调控修复细胞增殖的变化规律。实验结果表明1、3、7、日伤口渗出波可刺激修复细胞生长．而9、11、15日在高浓度胎牛血清（fetalcalfserum，FCS）存在时对修复细胞生长呈抑制作用,在低股牛血清时，后期伤口渗出液可诱导细胞死亡，可能系细胞凋零（Apoptosis）。愈合过程的后期伤口微环境中存在细胞生长抑制因子。

创伤渗出液对创伤成纤维细胞增殖的影响

创伤后不同时期渗出液（ｗｏｕｎｄｆｌｕｉｄ，ＷＦ）的质和量的变化，在很大程度上反映伤口组织的愈合进程．研究伤口不同天数的ＷＦ对小鼠伤口组织的成纤维细胞（ｍｏｕｓｅｗｏｕｎｄｆｉｂｒｏｌａｓｔ，ｍＷＦｂ）体外增殖能力的影响，探讨伤口微环境ＷＦ在调控ｍＷＦｂ的增殖规律．用两种培养基进行检测：１６４０培养基１０％ＦＣＳ（ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ胎牛血清）１０％ＷＦ或１６４０１％ＦＣＳ１０％ＷＦ．发现第１、３、７天的ＷＦ能刺激ｍＷＦｂ增殖．在高浓度（１０％）ＦＣＳ条件下，９、１１、１５天ＷＦ对ｍＷＦｂ生长产生抑制作用．而同一ＷＦ在低浓度（１％）ＦＣＳ时导致ｍＷＦｂ死亡．结果提示，在损伤后一周期间伤口微环境能刺激ｍＷＦｂ增殖，但伤后更长时间的ＷＦ使细胞生长受阻止．在创伤愈合晚期的微环境中可能存在一些生长抑制因子．

低温等离子体调控细胞增殖和凋亡的研究进展及其在畜牧业的应用

低温等离子体(non-thermal plasma,NTP)是轻度电离的等离子体,其离子和中性粒子温度远低于电子温度,使得整个放电体系呈现低温状态,目前广泛应用于灭菌消毒、疫苗生产、口腔治疗、伤口愈合和癌症治疗等生物医学领域。NTP产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)及活性氮(reactive nitrogen species,RNS)对于细胞增殖和凋亡的调控作用具有剂量依赖性,在低强度和短时间时,NTP产生较低水平的ROS和RNS可以诱导细胞增殖和血管生成,从而加速伤口愈合;高强度和长时间的NTP处理则会抑制细胞增殖甚至诱发细胞凋亡,但NTP调控细胞增殖和凋亡的机制及其在畜牧业的潜在应用目前还不清楚。因此本文综述了NTP对内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、干细胞和恶性肿瘤细胞的影响及可能机制,为NTP应用于伤口愈合和癌症治疗提供理论依据;并且本文还总结了NTP在畜禽动物的饲养环境与健康、生长与繁殖性能以及动物食品加工与保存方面的潜在应用,为促进我国畜牧业生产和保障动物食品安全奠定基础。

八珍汤对大鼠慢性难愈性创面肉芽组织增殖细胞核抗原与细胞凋亡的影响

目的:探讨八珍汤对慢性难愈性创面大鼠创面肉芽组织增殖细胞核抗原(PCNA)与细胞凋亡的影响。方法:选择雄性SD大鼠,于背部制造全层皮肤缺损开放性创面。除正常创面对照组外,其余肌肉注射醋酸氢化可的松建立难愈性创面模型,随机分为模型组和八珍汤组。观察创面愈合时间;通过免疫组化结合图像分析等技术,观察各组大鼠创面肉芽组织PCNA表达情况;通过流式细胞技术,观察各组大鼠创面肉芽组织细胞凋亡情况。结果:模型组创面愈合时间较正常组明显延长(P<0.01),八珍汤组创面愈合时间比模型组明显缩短(P<0.01);模型组PCNA表达明显低于正常组(P<0.05),八珍汤组PCNA表达明显高于模型组(P<0.01),而明显低于正常组(P<0.01);模型组细胞凋亡明显高于正常组(P<0.01),八珍汤组细胞凋亡明显低于模型组(P<0.01),而明显高于正常组(P<0.01)。结论:八珍汤能明显促进慢性难愈性创面大鼠的创面愈合,其机制可能与促进创面肉芽组织细胞增殖,抑制创面肉芽组织细胞凋亡有关。

血管紧张素Ⅱ及其受体表达在创面愈合过程中的变化及作用

目的 观察创面愈合过程中血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）及其受体表达的动态变化,以及这种变化与创面愈合过程中细胞增殖和凋亡活动之间的关系,探讨AngⅡ在创面愈合过程中的可能作用.方法 建立小鼠背部全层皮肤缺损创面模型,于创面形成后第0、1、3、5、7、9、11、13、15天切取创面组织标本,用ELISA法检测创面局部组织AngⅡ产生的变化;采用BrdU及TUNEL染色检测创面细胞增殖和凋亡的变化;用免疫组织化学染色和RT-PCR检测创面局部组织AngⅡ受体AT1和AT2表达的组织细胞定位和mRNA水平的变化.结果 小鼠全层皮肤缺损创面局部组织AngⅡ、BrdU标记指数均在伤后逐渐增加,并于第7天达到峰值后即逐渐下降.TUNEL染色阳性细胞数在伤后即开始缓慢增加,并于创面完成上皮化后增加趋势更为明显.正常小鼠皮肤AT1和AT2受体在整个表皮层均有阳性表达,但在真皮层,AT1和AT2受体仅在微血管内皮细胞有阳性表达.AT1受体在角质形成细胞、成纤维细胞均有表达,阳性染色信号在伤后逐渐增加,在第7天最强,以后逐渐下降.AT2受体阳性染色信号也在伤后逐渐增加,7 d以后则逐渐下降.但当创面上皮化完成后,AT2受体阳性染色信号再次增加.RT-PCR结果 显示：AT1和AT2受体mRNA均有表达,AT1、AT2受体mRNA表达在伤后第7天均达到峰值,此后则逐渐下降,且AT2受体mRNA表达在创面上皮化完成后表达再次增加.结论 在创面愈合过程中,AngⅡ可能通过其产生及受体表达的变化调控创面的愈合及后期的塑形改建.AT1受体可能与细胞增殖活动密切相关;AT2受体可能与细胞凋亡及愈合过程中组织重建有关.

树突状表皮T淋巴细胞对小鼠创缘表皮细胞增殖和凋亡的影响

目的了解树突状表皮T淋巴细胞(DETC)对小鼠创缘表皮细胞增殖和凋亡的影响及其在创面愈合中的作用。方法选取无特殊病原体(SPF)级野生型C57BL/6健康8~12周龄雄性小鼠28只、SPF级8~12周龄T淋巴细胞受体δ敲除(TCRδ-/-)雄性小鼠60只用于如下实验。(1)采用随机数字表法取8只野生型小鼠分离表皮细胞、原代培养DETC,并于培养即刻及培养15、30 d行DETC形态学观察和采用流式细胞仪检测纯度。(2)采用随机数字表法取5只野生型小鼠、5只TCRδ-/-小鼠,分别设为野生型对照组、TCRδ-/-组,每只小鼠背部制作直径6 mm圆形全层皮肤缺损创面。观察伤后即刻及伤后2、4、6、8、10 d创面愈合情况、计算剩余创面面积百分比。(3)同实验(2)取小鼠,分组并制作全层皮肤缺损模型。伤后3 d取创缘组织进行苏木精-伊红染色,检测新生上皮长度。(4)同实验(2)取小鼠,分组并制作全层皮肤缺损模型。伤后3 d取创缘表皮组织,采用蛋白质印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,评估表皮细胞增殖情况。(5)同实验(2)取小鼠,分组并制作全层皮肤缺损模型。伤后3 d取创缘的表皮组织消化成单细胞悬液,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。(6)取40只TCRδ-/-小鼠,同前行实验(2)^(5)检测,并采用随机数字表法分为TCRδ-/-对照组和TCRδ-/-+DETC组,每个实验每组5只小鼠。其中小鼠背部同前造成全层皮肤缺损,TCRδ-/-+DETC组小鼠伤后即刻于创缘多点注射1×105个DETC(溶解于100μL磷酸盐缓冲液,纯度超过90%),TCRδ-/-对照组小鼠同法注射等体积磷酸盐缓冲液。对数据行重复测量方差分析、t检验及Bonferroni校正。结果(1)随着培养时间的延长,DETC树突状突起的数量逐渐增多。培养即刻,4.67%的细胞是T淋巴细胞,这部分T淋巴细胞中94.10%为DETC。培养15 d时DETC纯度达18.50%,培养30 d时DETC纯度达98.70%。(2)伤后即刻,TCRδ-/-组、野生型对照组小鼠的创面情况相似;TCRδ-/-组小鼠伤后2~10 d的创面愈合速度慢于野生型对照组。与野生型对照组小鼠比较,TCRδ-/-组小鼠伤后2、4、6、8、10 d剩余创面面积百分比均明显升高(t=3.492、4.425、4.170、4.780、7.318,P<0.01)。(3)TCRδ-/-组小鼠伤后3 d创缘新生上皮长度为(359±15)μm,明显短于野生型对照组的(462±26)μm(t=3.462,P<0.01)。(4)TCRδ-/-对照组小鼠伤后即刻的创面情况与TCRδ-/-+DETC组相似;TCRδ-/-+DETC组小鼠伤后2~10 d的创面愈合速度明显快于TCRδ-/-对照组。与TCRδ-/-对照组比较,TCRδ-/-+DETC组小鼠伤后2、4、6、8、10 d剩余创面面积百分比明显降低(t=2.308、3.725、2.698、3.707、6.093,P<0.05或P<0.01)。(5)TCRδ-/-+DETC组小鼠伤后3 d创缘新生上皮长度为(465±31)μm,明显长于TCRδ-/-对照组的(375±21)μm(t=2.390,P<0.05)。(6)伤后3 d,TCRδ-/-组小鼠创缘表皮细胞的PCNA表达量为1.25±0.04,明显低于野生型对照组的2.01±0.09(t=7.415,P<0.01)。(7)伤后3 d,TCRδ-/-+DETC组小鼠创缘表皮细胞的PCNA表达量为1.62±0.08,明显高于TCRδ-/-对照组的1.05±0.14(t=3.561,P<0.05)。(8)伤后3 d,TCRδ-/-组小鼠创缘表皮细胞凋亡率为(16.1±1.4)%,明显高于野生型对照组的(8.1±0.6)%(t=5.363,P<0.01)。(9)伤后3 d,TCRδ-/-+DETC组小鼠创缘的表皮细胞凋亡率为(11.4±1.0)%,明显低于TCRδ-/-对照组的(15.4±1.4)%(t=2.377,P<0.05)。结论DETC可通过促进小鼠创缘表皮细胞的增殖、抑制其凋亡,参与创面愈合过程。