融合基因umcel5N-CBM的构建、表达及融合酶性质分析

碳水化合物结合组件(carbohydrate-binding module,CBM)是一些糖基水解酶分子上的结构域,它在纤维素酶降解不可溶纤维素中起着重要的作用。本研究的目的是检测一个新的内切葡聚糖酶Umcel5N(GenBank登录号为ACH67609)加上一个碳水化合物结合组件后得到的融合酶是否获得降解结晶纤维素的能力。本文将编码内切葡聚糖酶Umcel5N的催化结构域(catalytic domain,CD)的序列与编码Umcel6A的CBM序列通过接头序列进行基因融合,得到融合基因umcel5N-CBM,并实现了融合基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中的表达。研究结果表明,融合酶Umcel5N-CBM与结晶纤维素(avicel)以及滤纸粉末的结合能力比原始酶Umcel5N提高了约一倍,但未显示出降解结晶纤维素的新活性,说明在结晶纤维素的降解过程中,纤维素酶的催化功能域起到关键作用。

CBM-TOF超级模块高密度数据前端读出设计

为满足超级模块探测器质量评估的数据读出需求,设计了一种基于"三明治"结构的前端高密度数据读出方法。利用FPGA技术实现320通道时间数字化数据读出和自定义协议处理,并通过片内高速串行收发器与光纤进行长距离数据传输。在外部回环模式下的测试结果表明,6 Gb/s高速链路误码率小于10-13的置信度超过95%,接收TDC数据和自定义协议处理功能正常,系统连续稳定运行超过48 h,可满足探测器评估需求。

用于CBM-TOF超级模块探测器质量控制的分布式数据读出方法

高压缩重子物质(Compressed Baryonic Matter,CBM)实验装置飞行时间谱仪利用由多气隙电阻板室(Multi-gap Resistive Plate Chamber,MRPC)探测器构建的超级模块实现高密度、高精度的粒子飞行时间测量,该超级模块可支持高达320通道的高精度时间测量能力,数据率高达6 Gbit·s^(-1)。为实现超级模块探测器的性能评估,提出一种基于千兆以太网的分布式数据读出方法,利用片上系统技术实现读出节点的千兆网络传输能力。测试结果表明,针对单条数据传输路径,原型读出模块在全链路情况下,能实现约467 Mbit·s-1的综合数据传输速率。读出方案中事例组装、命令发送、状态显示等功能均运行正常。

纤维素结合域的研究进展

纤维资源是生物界最为丰富的有机碳源,有效酶解植物纤维资源对于减缓能源枯竭和食品危机具有重要意义。然而,天然纤维素结构上的复杂多样性为酶的攻击和可及带来巨大困难。为了克服这一问题,自然界中能够利用纤维原料的酶大多由相对独立的两种结构域、催化结构域(CD)、纤维素结合结构域(CBM)组成。其中,CBM有助于酶与不溶性底物的结合,在纤维原料酶解中具有重要作用。CBM所具备的特殊的底物特异性不仅对于提高酶与纤维的可及度,增强纤维素酶解效率,揭示纤维素酶解机制具有重要意义,而且应用在基因工程产品的分离纯化,酶制剂的品质改善及细胞固定化等领域也有很好的发展前景。本文就近年来CBM的研究现状及其发展前景进行了综述。

能降解天然纤维素的地衣芽孢杆菌GXN151的分离鉴定及其一个纤维素酶基因(cel5A)的克隆和测序分析

从广西大学农场陈旧稻草堆中分离出1株具有降解天然纤维素稻草粉、甘蔗渣粉活性的细菌GXN151,经形态观察、16SrDNA序列分析和丙酸盐利用试验将其鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。通过连接经BamHI酶切的pBluescriptKS(+)和回收得到的经Sau3AI部分酶切的GXN151的3～10kbDNA在大肠杆菌JM109中构建了该菌的含7099个克隆的基因文库,文库克隆中插入片段最大的为11.0kb,最小的为3.1kb,平均大小为4.6kb,含GXN151基因组中任一基因的概率P为99.6%。筛选该文库获得8个表达羧甲基纤维素酶活性的克隆,DNA测序和PCR分析表明,该8个克隆可归为3类不重叠的独立克隆,其中一个克隆pGXNL2的测序分析表明其上的cel5A基因为1626bp,可编码含542个氨基酸的羧甲基纤维素酶,Cel5A的N-末端的42个氨基酸具有信号肽特征,它的第66～321氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域、第391～472氨基酸为家族3碳水化合物结合组件(carbohydrate-bind-ingmodule,CBM)。本工作首次报道地衣芽孢杆菌能降解结晶纤维素及从该种细菌中克隆到纤维素酶基因。

设备预维修诊断系统技术

首先介绍预维修诊断系统的特点、组成和相关模块的作用,然后通过国内外研究现状得出预维修诊断系统开发的前提和两项关键技术——数据的处理过程和诊断故障位置算法的选择;最后分析和研究了国外直升机预维修诊断系统的开发实例。

木聚糖酶纯化的研究进展

色谱技术由于具有高的分辨率一直以来都是木聚糖酶最重要的纯化技术。然而它耗时、低回收率和高花费的特点促使人们不断探索新的方法以满足工业应用上对木聚糖酶的需要。本文综述了木聚糖酶传统的纯化策略及最近其它较有发展前景的纯化技术,尤其是ATPS和CBM在纯化上的应用潜力。

壳聚糖酶的分子结构与作用机制的研究进展

壳聚糖是由N-乙酰-α-氨基-D-葡萄糖胺以β(1→4)糖苷键连结而成的线性水不溶性多糖。壳聚糖酶是水解部分乙酰化壳聚糖产生寡聚糖终产物的酶。为了提高酶法生产效率,研究人员对壳聚糖酶进行了深入的研究。本文主要对壳聚糖酶(含外切壳聚糖酶)的种类、酶的晶体结构、酶与壳聚糖的作用机制、酶的结合结构域的结构和功能、酶解特点进行综述,揭示了酶的壳聚糖结合结构域的特征,不同壳聚糖酶如何作用于壳聚糖生产活性寡聚糖。本文为筛选和改造壳聚糖酶奠定基础,对于提高酶效具有重要的意义。

碳水化合物结合结构域的研究进展

碳水化合物结合结构域(Carbohydrate-binding modules,简称CBM)是与碳水化合物结合的非催化蛋白结构域,不具有催化活性但参与碳水化合物降解的多糖结合模块,已在微生物中得到充分研究。它能够特异性结合多糖,有效提高碳水化合物酶的催化效率,因其独特的结合特性也成为了研究蛋白质-碳水化合物作用机制的模型。CBM融合表达以及底物结合机制的探索对于CBM在碳水化合物活性酶的分子研究具有重要意义,相关技术广泛应用于生物质资源利用领域。对近年来CBM的作用机制、重组融合以及在纤维素改性、生物材料、分子探针等领域的应用进行综述。

MZJ20DB集装箱式煤层气钻机

针对国内煤层气勘探开发的作业特点,设计研制了模块小、质量轻、拆卸及安装快捷的MZJ20DB集装箱式煤层气钻机。该钻机模块采用集装箱式结构,主要由集装箱式多节套装井架、底座、主机橇、电控房、发电机房和固控罐等组成;满足山地复杂路况的运输要求,各模块尺寸控制在长10 m、宽3 m以内,质量控制在20 t以内;整体布局合理紧凑,井场面积40 m×20m;采用集成化设计,共15个模块,仅为常规2 000 m钻机运输模块的;符合煤层气开发的低成本要求。主机设计有液压整体平移装置,满足煤层气钻机打丛式井的要求。

SpyTag/SpyCatcher作用于多酶固定化系统的应用研究

利用一组相互作用多肽对SpyTag/SpyCatcher之间的特异相互作用,以麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)为作用酶研究其固定化的应用效果。将SpyCatcher与具有高亲和力的纤维素结合模块(CBM)融合,得到融合蛋白SC-CBM,利用CBM与纤维素之间的吸附作用将融合蛋白固定于纤维微球,形成稳定且通用的固定化载体,实现了79.8%的载体回收率。作用酶分别与SpyTag融合形成融合蛋白ST-treY和ST-treZ,其与SC-CBM之间的相互作用发现结合率分别达到60.3%和63%。应用此种特异性对接作用完成了ST-treY和ST-treZ在发酵液中的一步纯化及固定化,固定化率分别能达到69.6%和68.4%。因此,实现了SpyTag/SpyCatcher作为媒介的多酶固定化,为未来的多酶固定化系统打开了新思路,形成了通用固定化载体,节省了固定化步骤与成本,且能达到较高的回收效率。

用于CBM-TOF超级模块质量评估的SoC数据读出方法

在高压缩重子物质(Compressed Baryonic Matter,CBM)实验中,多气隙电阻板室(Multi-gap Resistive Plate Chamber,MRPC)探测器被用于构建飞行时间(Time of Flight,TOF)谱仪。根据CBM实验需求,TOF谱仪被设计成由6种不同类型的超级模块构成的探测器墙。每个模块最多包含5块MRPC探测器,能提供320路电子学通道,单个模块的数据率高达6 Gbps。为了评估CBM-TOF超级模块的性能,本文提出了一种基于TCP/IP千兆以太网技术的数据读出方法。考虑到TCP/IP协议的复杂性,该方法利用Altera SoC FPGA从前端电子学接受数字化的时间数据,并通过千兆以太网并行地发送数据到DAQ软件。实验室测试结果表明,单个读出扣板全链路读出速率达到550 Mbps,能够用于CBM-TOF MRPC探测器质量评估。

嗜冷嗜酸β-1,4-木聚糖酶及其钙离子依赖型碳水化合物结合模块

【目的】β-1,4-木聚糖酶是木聚糖降解的关键酶之一,嗜冷嗜酸木聚糖酶在功能性低聚木糖的制备中具有重要作用,但相关报道较少。【方法】从太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica)菌株WPAGA1基因组发掘到一条新型的木聚糖酶序列,经基因合成、质粒构建和表达,并对其进行分离纯化及酶学性质研究。【结果】该木聚糖酶(Xyl4513)具有2个保守结构域,一个属于糖苷水解酶11家族(glycoside hydrolase family 11,GH11)催化模块(Xyl4513-T),另一个属于碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)60家族(CBM4513),这是一种非常罕见的GH11家族木聚糖酶含有CBM的现象。纯化后的Xyl4513最适反应温度和pH值分别为30℃、3.0,这一特性说明Xyl4513为嗜冷嗜酸β-1,4-木聚糖酶;而截短的木聚糖酶Xyl4513-T最适反应温度和pH值分别为20℃、4.0,且催化效率(kcat/Km)较前者下降了20%,说明CBM4513对酶稳定性和催化效率有较大影响。Ca^(2+)、Mg2+和Ni2+对酶催化活性均有明显促进作用,其中Ca^(2+)效果更为明显。仅当含有Ca^(2+)时,CBM4513才对β-1,4-木聚糖具有特异性结合能力,属于Ca^(2+)依赖型CBM,其最大结合量为9.13μmol/g。【结论】本文获得了一种新型的嗜冷嗜酸木聚糖酶和相应的Ca^(2+)依赖型CBM,进一步丰富了它们的基因和蛋白资源。

提高内切葡聚糖酶活力及其在毕赤酵母中的表达研究

以中性内切葡聚糖酶基因EG和真菌Corticium rolfsii的碳水化合物结合模块（FCBM）为模块，构建融合基因重构体EG-FCBM和CD-FCBM，并利用高效表达载体在毕赤酵母中对其进行高效表达。酶活及性质分析显示，EG-FCBM和CD-FCBM在诱导表达84～96h后，其对微晶纤维素的活力分别为951和676U·mL^-1，较原始基因EG（526U·mL^-1）提高81％、28％，而酶学性质两者间无较大差异。这一结果表明，FCBM在催化水解纤维素的过程中有着极为重要的作用，通过增加FCBM来提高纤维素酶活性方法可行。

碳水化合物结合结构域研究进展

糖类是自然界数量最多的一类有机化合物,生物对其降解利用是最重要的反应之一。碳水化合物酶是具有降解、修饰和生成糖苷键功能的一大类酶。由于高分子糖类可溶性低,其糖苷键难以触及,因此其被酶作用的效率相对较低。碳水化合物结合结构域能特异性结合多糖底物,对提升糖类底物的酶催化效率起着关键的作用。本文从碳水化合物结合结构域的家族类型、结构类型、结构与功能关系以及与催化结构域的关系几个方面进行了综述,对阐明碳水化合物结合结构域与碳水化合物识别机制,进而将其广泛应用于生物和医疗领域具有重要意义。

碳水化合物结合组件的点突变研究

碳水化合物结合组件(carbohydrate-binding module,CBM)是某些碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes)上的非催化部分,主要负责与底物特异性结合以提高与之相邻的催化结构域对不可溶底物的催化效率。CBM中的保守芳香族氨基酸通常是这些蛋白的底物结合位点,利用氨基酸定点突变技术可用来寻找和验证CBM中的结合位点的关键氨基酸。本研究的前期工作发现CBM46200与其同家族的其它成员相比对底物结合的能力要弱很多,多重序列比对发现家族中某些保守的芳香族氨基酸在CBM46200被非芳香族氨基酸替代,这可能是CBM46200与底物结合能力弱的原因,探究这些原因对研究前期工作中所鉴定的新家族CBM的广泛特异性具有重要意义。在本研究中利用氨基酸定点突变技术、亲和凝胶电泳技术以及蛋白对不可溶多糖的吸附技术等对前面的推论予以验证。结果表明,CBM46200的定点突变体对多糖底物的结合能力并没有增强,有些甚至还减弱了,这说明这些非芳香族氨基酸在CBM46200中的替代不是造成CBM46200对多糖的结合能力弱于其它家族成员的原因,可能还存在其它的因素影响CBM46200对底物的结合能力,本文对这些可能的因素也做了推测。