鸡γ-干扰素与补体受体2蛋白相互作用的研究

【目的】研究鸡γ-干扰素(chicken interferonγ,chIFN-γ)与鸡补体受体2(chicken complement receptor 2,chCR2)蛋白的相互作用,为研究chIFN-γ和chCR2新功能奠定基础。【方法】通过同源重组方法构建chIFN-γ相关表达质粒,利用免疫共沉淀、激光共聚焦和表面等离子共振技术鉴定chIFN-γ与chCR2蛋白的相互作用,并通过分子对接技术模拟chIFN-γ与chCR2蛋白的相互作用模式。【结果】成功构建了pCMV-Myc-chIFN-γ表达质粒。将pCMV-Myc-chIFN-γ和pCMV-HA-chCR2-ΔTM质粒共转染HEK-293FT细胞,结果表明chIFN-γ蛋白可以与chCR2蛋白进行相互作用;将pCMV-Myc-chIFN-γ和pCMV-HA-chCR2-ΔTM质粒共转染DF-1细胞,结果表明chIFN-γ蛋白与chCR2蛋白可以在DF-1细胞中进行共定位。表面等离子共振试验结果显示chIFN-γ与chCR2蛋白之间的平衡解离常数(KD)值为0.362μmol/L,二者之间有较高的亲和力。分子对接试验结果显示,chIFN-γ与chCR2蛋白之间的相互作用模式为Asp23-His150间形成1组盐桥作用,Asn37-Ser143、Glu57-Gly179和Ile93-Tyr184间形成3组氢键作用。【结论】本研究结果证明了chIFN-γ与chCR2蛋白可以进行相互作用,且二者之间的作用模式为1组盐桥和3组氢键作用。

植物体瞬时表达ChIFN-γ蛋白研究

以生菜、洋葱、萝卜为试材,用转入植物表达载体pSH-NGN的根癌农杆菌EHA105分别采用真空渗透法和直接注射法瞬时表达ChIFN-γ蛋白,研究其最佳宿主植物和最佳方法。结果显示,真空渗透法和直接注射法在瞬时表达效率上差异不大,真空渗透操作上更简便、更易掌握;新鲜市售生菜,真空抽气25 min,共培养3 d,瞬时表达效率达到3 645 pg/g,ChIFN-γ蛋白得到高效表达。

转ChIFN-γ烟草对雏鸡的增重及免疫保护作用研究

[目的]为转ChIFN-γ烟草通过口服喂养途径进行免疫应用提供试验依据。[方法]将转ChIFN-γ基因烟草叶片添加到饲料中饲养雏鸡,接种新城疫病毒(NDV)后观察ChIFN-γ疫苗佐剂通过口服喂养方式对雏鸡的增重效果和免疫保护作用。[结果]口服转ChIFN-γ烟草对雏鸡的体重增长有一定促进作用;喂养含转ChIFN-γ烟草叶片饲料1～10d的雏鸡对NDV均表现出不同程度的抗性,其中喂食3d3600UChIFN-γ的效果最好。[结论]该研究表明通过口服转ChIFN-γ烟草叶片来防治鸡新城疫病是可行的。

重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α的构建及其与ND、IB二联活疫苗联用对鸡免疫功能的影响

为研究重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α与鸡新城疫(Newcastle disease,ND)、传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)二联活疫苗联用最佳肌肉注射剂量及其对鸡免疫功能的影响。通过RT-PCR扩增鸡干扰素-α(IFN-α)基因,双酶切IFN-α基因和pcDNA3.1(+),T4 DNA ligase连接,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α;挑选180只海兰褐公雏鸡随机分为6组,每组3个重复,每个重复10只。A组(生理盐水对照组)、B组(疫苗对照组)、C组[疫苗+100μg pcDNA3.1(+)对照组]、D组[疫苗+50μg pcDNA3.1(+)-ChIFN-α试验组]、E组[疫苗+100μg pcDNA3.1(+)-ChIFN-α试验组]、F组[疫苗+200μg pcDNA3.1(+)-ChIFN-α试验组];4日龄时,D、E、F组分别注射pcDNA3.1(+)-ChIFN-α50、100、200μg/只,C组注射pcDNA3.1(+)100μg/只,A、B组注射生理盐水300μL/只,7日龄时除A组外,其他各组均滴鼻、点眼免疫鸡ND、IB二联活疫苗,于49日龄时,对试验鸡进行肾型IB病毒(Nephropathogenic IB virus,NIBV)攻毒试验。PCR结果表明扩增出鸡IFN-α基因为582 bp,通过测序并与NCBI已发表的ChIFN-α基因(登录号EU367971)进行比对,同源性为100%;双酶切、菌液PCR及测序鉴定结果表明重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α构建成功;动物试验结果表明,不同剂量pcDNA3.1(+)-ChIFN-α均能提高鸡外周血阳性T、B淋巴细胞百分率;提高ND病毒(ND virus,NDV)、NIBV疫苗诱导的抗体水平,并能提高鸡对NIBV强毒株的免疫保护率,且100μg剂量组比疫苗对照组的免疫保护率提高10%。本研究确定重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α最佳注射剂量为100μg/只鸡,其不仅能发挥免疫佐剂作用,还可增强鸡ND、IB二联活疫苗免疫保护效果。

T1代转ChIFN-γ基因烟草鉴定及其生长表现

鸡γ干扰素(ChIFN-γ)是一类具有抗病毒和免疫保护等广泛生物学活性的禽病防治有效药物,通过植物生物反应器表达生产是降低其生产成本和扩大临床应用范围的重要途径。为获得可以利用的ChIFN-γ转基因烟草生物反应器,本文在对T1代转ChIFN-γ基因烟草(TP)进行遗传稳定性检测的基础上,对其株高、叶片、根系及活力等指标进行测定,探讨外源基因表达对受体植物生长发育的影响。结果表明,TP烟草幼苗在移栽后植株较高,生长较快,叶片较多。株高增长以第7d时最为明显,3个株系的相对生长速度分别为野生型(WT)的253.23%、280.12%和260.42%;TP-1、TP-2和TP-3株系叶片数相对生长速度分别在第28d、28d和14d时达到最大,为WT的117.33%、118.84%和143.79%;在15d时TP株系组培苗的生根数和根系长分别为WT的9.09倍、7.06倍、5.06倍和2.23倍、2.66倍、2.41倍;水培条件下TP株系具有较高的根系活力,以第10d时最明显,分别为WT的1.12、1.44、1.39倍。因此,转ChIFN-γ基因烟草具有一定的生长优势,未表现出生长抑制现象,研究结果为ChIFN-γ转基因植物生物反应器的进一步应用研究提供了依据。

鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究

通过PCR从三黄肉鸡的肝脏基因组中扩增了鸡α干扰素(ChIFN-α)全长基因。序列分析表明ChIFN-α基因全长582bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因(489bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET-28a(+)-IFNα,使IFN-α置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合。经酶切鉴定,DNA测序证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE,Western-blot分析证实表达出22kD左右的融合蛋白,表达的蛋白以不溶性的包涵体形式存在并且具有良好的免疫学活性。提纯的包涵体纯度可达70%以上,用镍亲和层析方法纯化蛋白则可达到95%。经透析复性后的蛋白在鸡胚成纤维细胞上能够抑制H9N2禽流感病毒的复制。鸡胚试验中重组干扰素抗病毒效果好在H9N2禽流感病毒攻毒组中,能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2μg;重组干扰素对新城疫病毒复制也有一定的抑制能力,延迟该病毒复制时间为12h至48h;雏鸡试验表明重组干扰素也能较好地抵抗H9N2禽流感病毒对雏鸡的感染。两组试验均表明,亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右。

抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的研制及初步鉴定

目的:制备抗鸡γ-干扰素单克隆抗体(mAb)。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)(pET-ChIFN-γ)表达产物的包涵体作为抗原免疫BALB/c鼠,以纯化的GST-ChIFN-γ作为检测抗原,制备抗鸡γ-干扰素mAb;采用ELISA、Dot-ELISA和Westernblot鉴定mAb的特异性。结果:获得2株可稳定分泌抗鸡γ-干扰素mAb的杂交瘤细胞株1G5、5E3,其Ig亚类均为IgG2a,腹水mAb1G5、5E3的ELISA效价分别为1∶1600000,1∶120000。在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-ChIFN-γ及GST-ChIFN-γ的重组大肠杆菌反应,与未表达这2种IFN-γ的其他8种菌株均不发生反应。在蛋白质印迹试验中,2株mAb均能与融合蛋白GST-ChIFN-γ、His-ChIFN-γ发生反应,出现特异性条带。结果表明,mAb1G5、5E3是针对鸡γ-干扰素的特异性mAb。结论:成功地制备抗鸡γ-干扰素的mAb,它们在免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节研究等方面有应用价值。

转ChIFN-γ基因烟草抗虫作用初步研究

对田间烟蚜的自然发生情况观察和抗虫试验的研究显示,转ChIFN-γ基因烟叶具有显著的抗虫效果.为探索转基因烟草的抗虫机理,测定了叶片中烟碱含量并对植株组织进行切片染色.结果表明,烟碱含量与对照无显著差异;转基因烟草叶片增厚,细胞致密,细胞壁增厚可能是导致抗蚜虫、抗斜纹夜蛾的最直接因素之一.

ChIFN-γ基因植物表达载体的构建与瞬时表达

为了使鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)基因在油菜中获得高效表达,优化了油菜偏爱的密码子,在ChIFN-γ的5′端添加Kozark序列,3′端增加内质网滞留信号肽SEKDEL.应用同尾酶将人工合成的ChIFN-γ,Napin特异性启动子及信号肽与NOS终止子克隆到质粒pSH中构建成植物表达载体pSH-NGN.经生菜瞬时表达,ELISA检测表明ChIFN-γ蛋白获得有效表达.研究结果为进一步遗传转化油菜奠定了基础,同时也对构建基因的正确表达提供了一种新的快速鉴定方法.

转ChIFN-γ基因烟草抗虫机制研究

为探索转ChIFN-γ基因烟草的抗虫作用机制,对虫体蛋白酶活性变化、烟草挥发性成分以及表皮腺毛密度进行了研究.结果表明,烟青虫进食转基因烟草量较少,导致其体内分泌蛋白酶量少、活力低;转基因烟草T0和T1代,黑松三烯和西柏三烯二醇相对含量较对照高;转基因烟草腺毛密度比对照高49.2%.ChIFN-γ基因激活的多种转录因子可能结合了腺毛发育相关基因的cis调节元件,上调了腺毛发育基因的表达,导致腺毛的数量增加,分泌的萜烯化合物增加从而具有显著的抗虫性.

基因工程表达鸡IFN-λ抗Ⅰ群禽腺病毒感染

Ⅲ型干扰素(IFN)又被称为IFN-λ,具有与Ⅰ,Ⅱ型IFN类似的抗病毒特性,但利用不同的配体-受体系统,主要在一些上皮细胞及免疫细胞上发挥作用。本研究评价了用昆虫杆状病毒表达系统制备的重组鸡IFN-λ(chIFN-λ)在体内、外对禽Ⅰ群腺病毒4型(FAdV-4)GX2013株和8b型(FAdV-8b)QD2016株感染的抗病毒效果。在体外抗病毒试验中,重组chIFN-λ在LMH细胞上对GX2013株和QD2016株的抗病毒效价分别达到1.33×10^6,1.78×10^6 U/mL。在体内抗FAdV-4感染试验中,重组chIFN-λ治疗组在攻毒5 d后试验鸡存活率达60%,而未进行治疗的对照组3 d内死亡率为100%。在体内抗FAdV-8b感染试验中,重组chIFN-λ治疗组和非治疗组试验鸡均无明显临床症状,但治疗组在攻毒5 d后呼吸道和消化道排毒水平均低于未治疗组,且差异极显著(P<0.01)。上述结果表明重组chIFN-λ作为一种新型的生物制剂,有望在禽腺病毒感染防控中发挥重要的作用。

基于抗原蛋白Fiber-2及细胞因子佐剂的Ⅰ群4型禽腺病毒亚单位疫苗的开发

为了开发一种抗I群4型禽腺病毒(FAd V-4)的亚单位疫苗,选择I群禽腺病毒血清4型流行毒株衣壳蛋白Fiber-2作为保护性抗原蛋白。利用昆虫细胞-杆状病毒系统生产Fiber-2蛋白,通过Westernblot检测重组蛋白的表达情况,利用双向琼脂扩散法检测重组Fiber-2的免疫原性。为了增强亚单位疫苗的免疫保护效果,添加鸡源白细胞介素2(chIL-2)和鸡源γ-干扰素(ch IFN-γ)作为免疫佐剂,与重组Fiber-2单独或混合使用,制备多种形式的亚单位疫苗,并进行动物攻毒保护试验。重组蛋白的Western-blot鉴定结果显示,63 ku处出现Fiber-2蛋白目的条带;双向琼脂扩散试验结果显示,重组蛋白效价达到1∶128,表现出良好的反应原性。动物攻毒保护试验结果显示,单独使用Fiber-2免疫SPF鸡,在50 μg/只的剂量下,可为SPF鸡提供100%的保护效果,以chIL-2和chIFN-γ为免疫佐剂,与重组Fiber-2联合免疫SPF鸡,可显著增强Fiber-2在低剂量(10 μg/只)下的免疫保护效果,上述结果表明重组Fiber-2联合chIL-2和chIFN-γ细胞因子佐剂所制备的亚单位疫苗在抗I群4型禽腺病毒感染领域具有良好的应用前景。

H5N1亚型禽流感灭活疫苗和DNA疫苗诱导IFN-γ应答评价

用H5N1亚型禽流感病毒(AIV)油乳剂灭活疫苗和携带H5N1亚型AIV血凝素(HA)的重组DNA疫苗pVAX1-HA分别免疫2周龄SPF鸡,共免疫3次,每次间隔4周。每次免疫后14d,每组随机取4只鸡,分离其脾脏淋巴细胞,用H5N1亚型AIV JS株灭活全病毒作为特异性体外刺激抗原刺激鸡脾脏淋巴细胞,72h后,检测其培养上清中特异性ChIFN-γ的水平,同时用HI试验检测免疫鸡血清抗体。结果表明:重组DNA疫苗pVAX1-HA免疫组在二次免疫后,可检测出特异性ChIFN-γ的分泌和一定水平的抗体应答;而H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫组均未能检测出ChIFN-γ,二次免疫后能产生较高水平的抗体应答。说明DNA疫苗可激发较高水平的IFN-γ应答,而AIV灭活疫苗主要激发抗体应答,提示两者联合免疫可使免疫的禽群诱导产生强的细胞免疫应答和抗体应答,为AIV的防控提供了参考。