pcDNA_(3.1)-ChIL-18的构建及其对鸡免疫功能的影响

根据GenBank中的鸡IL-18的基因序列,设计一对引物,成功克隆出ChIL-18基因,并通过双酶切ChIL-18和pcDNA3.1(+)再连接,成功构建真核载体pcDNA3.1-ChIL-18。将200μgpcDNA3.1-ChIL-18肌注到雏鸡腿部,研究其对雏鸡体重、脾脏指数、外周血液的活性T/B淋巴细胞数、外周血液红细胞的免疫功能、鸡新城疫活疫苗所诱导的抗体水平和鸡传染性支气管炎活疫苗所诱导的抗体水平,以及对受NIBV强毒攻击雏鸡的保护的影响。试验结果表明。

鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫细胞/杆状病毒系统中的表达

将编码鸡的白细胞介素 1 8(chickeninterleukine 1 8,ChIL 1 8)成熟蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB上 ,构建真核转移载体pMelBacBChIL 1 8,经限制性内切酶消化、ChIL 1 8特异引物PCR鉴定和确证性序列测定 ,证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacBChIL 1 8质粒与杆状病毒DNA(Bac N BlueTM DNA)共转染sf9昆虫细胞 ,经四轮蓝斑筛选纯化 ,获得了重组杆状病毒 ,命名为rBaculovirusChIL 1 8。提取病毒染色体DNA ,经ChIL 1 8特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定 ,证明获得了纯化的重组杆状病毒。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞 ,收获接种后不同时间的细胞进行SDS PAGE电泳。结果表明ChIL 1 8基因在昆虫细胞中获得了表达 ,表达的重组蛋白分子量约为 2 3kDa。应用在大肠杆菌原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIL 1 8多克隆抗体进行Westernblot分析 ,表明本研究真核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白和前期原核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白均具有生物学活性。

鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及其活性检测

首先将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18,mChIL-18)基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,然后转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10BacTM中,构建重组Bacmid(rBacmid)。通过脂质体介导法将纯化的rBacmid转染sf9细胞,获得完整重组杆状病毒,将达到一定滴度的重组杆状病毒感染sf9,收获感染后不同时间段的培养上清和细胞,经SDS-PAGE分析、Western-blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,分子量约为23KDa的重组蛋白在昆虫细胞中获得了表达;鸡淋巴细胞转化试验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验表明,表达产物具有良好的生物学活性。结论:在杆状病毒表达系统中成功表达了有活性的mChIL-18蛋白。

饲喂重组鸡白细胞介素18蛋白增加肉仔鸡体重的初步研究

经口服途径给肉仔鸡饲喂重组鸡白细胞介素 1 8(ChIL -1 8)蛋白 ,观察其在正常饲养条件下和人工感染鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)时对肉仔鸡的影响。将 84只肉仔鸡随机分为 2组 :正常称重组和IBV接种组。 2组肉仔鸡再随机各分为 3个亚组 ,分别每隔 5d各口服 1次PBS、细菌蛋白和重组ChIL -1 8蛋白。正常称重组每亚组 8只 ,每次口服前称重。IBV接种试验组每亚组 2 0只 ,在 30日龄时滴鼻接种IBVM41株并每隔 5d称重 1次。各亚组试验鸡分别在正压隔离器中饲养。结果表明 ,饲喂重组ChIL- 1 8蛋白的试验亚组肉仔鸡体重总增重量明显高于饲喂PBS和细菌蛋白的对照亚组 ;IBV接种试验组肉仔鸡在人工感染IBVM41株后 ,饲喂重组ChIL 1 8亚组的发病率和死亡率明显低于饲喂PBS和细菌蛋白亚组 ,而且后 2个亚组肉仔鸡临床症状也较饲喂重组ChIL- 1 8试验亚组明显。结果初步显示 ,饲喂重组ChIL -1 8融合蛋白能够增加肉仔鸡体重并可增强肉仔鸡对IBV感染的抵抗能力。

鸡白细胞介素18研究进展

鸡白细胞介素(IL-18)是一种新发现的细胞因子,其cDNA全长597 bp,编码198个氨基酸的前体多肽,分子量约为23 kDa,IL-18氨基端的29个氨基酸残基起胞内定位作用;鸡IL-18是IFN-γ诱生剂,通过IFN-γ发挥抗感染、促生长等作用,参与对微生物感染诱导产生细胞和体液免疫反应的初次免疫应答;鸡IL-18作为免疫佐剂,具有增强免疫和治疗作用,还具有抗肿瘤免疫作用。

H5亚型AIV HA1基因与鸡IL-18基因共表达载体的构建及其表达

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感(AIV)血凝素(HA)基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18基因的2对引物。然后分别以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFast-BacTMdual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTMdu-al的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTMdual-HA1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,并利用昆虫细胞进行转染。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。

鸡白细胞介素2和白细胞介素18基因的原核及真核表达

【目的】克隆并原核和真核表达无特定病原(SPF)鸡白细胞介素2(ChIL-2)和白细胞介素18(ChIL-18)基因,为后续开展ChIL-2和ChIL-18蛋白功能、生物学活性及联合应用的免疫佐剂研究打下基础。【方法】运用RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因,并进行测序和序列比对分析,分别构建其重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18及重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18,并将重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18分别转化大肠杆菌BL21,将重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18分别转染非洲绿猴肾(Vero)细胞。【结果】重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18经IPTG诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明融合蛋白ChIL-2和ChIL-18在大肠杆菌中获得高效表达,表达的蛋白分子量分别为27和23 kD;重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18转染Vero细胞24 h后进行倒置荧光显微镜检测,结果显示融合蛋白ChIL-2和ChIL-18在Vero细胞中均有较高表达。【结论】克隆获得的ChIL-2和ChIL-18基因可在原核和真核细胞中高效表达。

白细胞介素2和白细胞介素18对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗免疫作用的影响

为研究白细胞介素2和白细胞介素18对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗免疫作用的影响,将84只14日龄无特定病原(SPF)鸡随机分为7组,每组12只;分别设为NDV-IBV二联活疫苗组(对照组)、CHIL-2蛋白+NDV-IBV二联活疫苗免疫增强组、pVAX1-CHIL-2+NDV-IBV二联活疫苗免疫增强组、CHIL-18蛋白+NDV-IBV二联活疫苗免疫增强组、pVAX1-ChIL-18+NDV-IBV二联活疫苗免疫增强组、CHIL-2蛋白+CHIL-18蛋白+NDV-IBV二联活疫苗免疫增强组、p VAX1-CHIL2+pVAX1-ChIL-18+NDV-IBV二联活疫苗免疫增强组。7组鸡均于14日龄进行免疫注射,并于免疫后第0、7、14、21、28、35和42天时对各组鸡进行采血并测定血清中NDV和IBV抗体水平。免疫第48天后每组鸡随机挑取12只进行动物攻毒保护试验。结果表明,CHIL-2和CHIL-18不仅能够显著增强NDV-IBV二联活疫苗所诱导的免疫反应,而且还可以明显提高疫苗的保护率。

鸡白细胞介素18单克隆抗体的制备与鉴定

为制备鸡白细胞介素18(chIL-18)单克隆抗体,本试验从被沙门菌感染过的鸡脾脏DNA提取物中扩增chIL-18基因,并将其插入至原核表达载体pET-28a和pGEX-6p-1中,在大肠埃希菌中诱导表达并纯化重组蛋白;继而将纯化后的His-chIL-18蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,以GST-chIL-18作为筛选蛋白通过间接ELISA方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选,经3次亚克隆后,最后获得2株能稳定分泌IL-18抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2A7和2G5。对抗体纯化后进行鉴定,结果显示,2株抗体亚型均为IgG1,亲和力解离常数(Kd)分别为4.4×10^(-12)和2.06×10^(-10),与chIL-1、chIL-10和chIFN-β无交叉反应,可分别识别chIL-18第58~113位和第114~169位氨基酸区域。本试验制备的单抗为深入研究chIL-18的生物学功能及先天性免疫应答提供了有价值的手段。

鸡白细胞介素18与其受体复合物的表达、纯化与初步晶体学研究

白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)是IL-1家族中一种重要的细胞因子,在增强免疫、抗肿瘤等方面具有潜在应用价值。鸡IL-18(chicken interleukin-18,chIL-18)的cDNA于2000年被克隆,后续研究证明鸡IL-18与哺乳动物IL-18具有类似的生物学功能。IL-18可与靶细胞上的IL-18受体(IL-18R,包括IL-18Rα和IL-18Rβ)特异性结合形成受体复合物,介导细胞膜上的信号从胞外向胞内传递。作者在大肠杆菌中成功表达和纯化了chIL-18,利用昆虫细胞表达系统获得了chIL-18Rα和chIL-18Rβ的胞外结构域;他们还在体外重组并纯化了chIL-18/18Rα二元复合物与chIL-18/18Rα/18Rβ三元复合物,并生长出二元复合物晶体。这些工作为进一步测定chIL-18与其受体复合物的晶体结构,从而深入探讨chIL-18信号转导机制奠定了基础。