腺病毒载体介导编辑chNHE1基因对J亚群禽白血病病毒抗性研究

鸡Na~+/H~+离子交换蛋白-1(chNHE1)是J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的细胞受体,是ALV-J感染的细胞靶点。为了探索鸡抗禽白血病的育种目标,试验构建了定点编辑chNHE1基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统,并对编辑后细胞抗ALV-J感染能力进行评价。结果显示:使用CRISPR/Cas9腺病毒载体介导的ssODNs同源重组方案可以在chNHE1中引入突变,其中36%单克隆细胞株存在W38缺失;T37缺失的细胞对ALV-J感染具备极显著的抗性;W38缺失的细胞对ALV-J感染具有完全抗性,同时具有E35A替换、P36缺失、T37缺失的细胞对ALV-J感染也具有完全抗性。研究表明,CRISPR/Cas9腺病毒载体可以有效地编辑鸡DF-1细胞,W38缺失或E35A替换P36、T37缺失都可以使DF-1对ALV-J感染具有抗性,该方案为培育抗ALV-J感染的基因编辑鸡提供技术储备。

鸡chNHE1精准基因编辑细胞系的构建及其抗ALV-J感染的研究

旨在构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系,本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统,在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变,W38进行缺失,同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分选获得48株单克隆细胞系,PCR及测序分析结果显示,其中有14株单克隆细胞系的chNHE1成功发生V33突变、W38缺失以及34-37位氨基酸的密码子同义替换,基因编辑效率为29%。为了验证chNHE1基因编辑DF-1细胞系的遗传稳定性及增殖水平,对传至第25代的细胞系进行测序分析,结果显示,chNHE1基因未发生回复性突变;进一步细胞计数分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系增殖水平未受到影响;为了评价chNHE1基因编辑细胞系抗ALV-J感染的能力,分别利用ALV-J荧光报告病毒(ALV-J-GFP)及ALV-J原型毒株(HPRS-103)对其进行病毒感染试验,荧光观察结果及流式细胞分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI ALV-J-GFP的感染;进一步间接免疫荧光试验、PCR扩增试验以及病毒滴度测定试验结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI HPRS-103毒株及0.1 MOI JL08CH3-1毒株的感染。本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统结合流式细胞分选,成功构建了chNHE1基因编辑细胞系,其可完全抵抗ALV-J的感染,且该细胞系遗传稳定性及增殖活性良好,为建立抗ALV-J感染的新技术提供了理论支持及基因编辑靶点。

禽白血病病毒受体研究进展

禽白血病病毒相关受体的研究是解析白血病病毒感染机制的重要基础,也为禽白血病的防控与遗传育种提供了新的切入点。本文对近年来禽白血病病毒受体的相关研究进行回顾,概述不同亚群病毒受体的结构与其相关功能,分析受体介导病毒感染的分子机制,为进一步深入研究禽白血病病毒的感染和致瘤机制提供参考。

禽白血病病毒J亚群自然感染蛋鸡病毒负载、受体表达及致瘤谱关系

J亚群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)通过与宿主细胞膜上的受体chNHE1蛋白结合感染细胞并引起宿主发病,进而引起肿瘤。本研究对确诊为ALV-J感染的肿瘤携带鸡进行病理组织学观察和病毒分离,应用荧光定量PCR技术检测ALV-J自然感染蛋鸡体内ALV-J负载量与其受体chNHE1蛋白mRNA表达量,分析ALV-J负载量、受体表达量及致瘤谱之间的相关性。结果显示:ALV-J在蛋鸡及地方品种鸡体内所诱发的肿瘤呈现多样化,但是病毒负载量与肿瘤谱相关性不明显;ALV-J负载量与chNHE1蛋白mRNA表达量呈正相关;组织在发生肿瘤时chNHE1蛋白mRNA表达量升高,可见,chNHE1蛋白不仅是ALV-J感染宿主细胞的受体,而且在肿瘤形成过程中也发挥重要作用。本研究为ALV-J致瘤机制的深入研究提供了科学基础。