版纳微型猪近交系CPN10克隆、亚细胞定位、组织表达和生物信息学分析

【目的】以版纳微型猪近交系(BMI)为材料克隆CPN10基因,从亚细胞、m RNA水平及生物信息学方面初步探索其结构及功能特性,为该基因在猪—人异种器官移植免疫排斥中的作用研究奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法获得CPN10基因c DNA序列,应用分子克隆技术构建目的基因和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-CPN10,将其转染猪肾细胞PK15进行瞬时表达,通过EGFP示踪CPN10在PK15细胞中的表达和定位。进一步应用荧光定量技术明确其mRNA的多组织表达特征。最后利用生物信息学分析CPN10蛋白质的结构特征。【结果】得到BMI CPN10 CDS 309 bp序列(GenBank登录号:KM098149),成功构建了BMI CPN10基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-CPN10,转染PK15细胞且主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白表达。多组织荧光定量表达分析表明:BMI CPN10 mRNA在皮肤中具有最高表达量,在肝和肾上腺中的表达量较高,在其余各组织中呈中低度表达或几乎不表达。生物信息学分析表明:CPN10编码102个氨基酸,其蛋白分子量为10.93 ku,等电点为8.89,含1个CPN10保守结构域和5个磷酸化位点,二级结构以延伸链结构为主,无跨膜螺旋结构和信号肽。【结论】CPN10基因定位在细胞质中,在皮肤中高表达,该研究结果为进一步研究该基因在免疫排斥方面的功能奠定了理论基础。

人热休克蛋白10和鼠热休克蛋白10的克隆、序列分析及其原核表达

提取人肝癌SMMC-7721细胞和小鼠NS0细胞总RNA,对热休克蛋白10基因(Hsp10)进行RT-PCR扩增、TA克隆和测序。结果表明,从上述2种细胞中获得的cDNA分别由312,313 bp组成,与报道的人HSPE1 mRNA(NM-002157)、鼠肌肉Hspe1 mRNA(NM-008303)序列同源性分别为99%,97%,命名为HSPE1-1和Hspe1-1,序列分析表明,二者之间在核苷酸水平上的同源性为92%,氨基酸水平上的同源性为97%。将上述2种cDNA进行双酶切、亚克隆,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSPE1-1与pET-28a-Hspe1-1,转化大肠杆菌并进行了诱导表达。检测结果表明,pET-28a-HSPE1-1与pET-28a-Hspe1-1均能在大肠杆菌中表达,表达蛋白分子量大小约为14 kDa,与预期大小一致。Western-Blot结果证实了其为目的蛋白,经镍树脂柱纯化,获得了相应的重组蛋白。为进一步研究这2种蛋白的结构、功能及临床应用奠定了基础。

猪伴侣蛋白10基因克隆和鉴定

目的克隆猪伴侣蛋白 10 (chaperonin 10 ,cpn10 )基因并比较其在不同种属间的序列同源性。方法利用抑制消减杂交技术 (SSH)、DNA序列测定技术、表达序列标记 (EST)拼接技术、生物信息学分析、RT -PCR等进行研究。结果首次成功获得全长的猪cpn10cDNA序列。与人、牛、大鼠、小鼠的cpn10相比 ,在核苷酸水平上的同源性分别为 94 %、94 %、88%、88% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 10 0 %、10 0 %、99%、96 %。功能区分析发现 ,猪cpn10蛋白由 10 2氨基酸组成 ,分子量为 10 930 .97,等电点为 8.90 ,无N端信号肽序列 ,C端无核定位信号 (NLS)。RT -PCR结果显示 ,在未灭活补体人血清 (C -HS)作用下 ,猪内皮细胞cpn10基因表达上调。结论cpn10是进化上高度保守的基因 ,可能与猪到人异种移植排斥反应相关。

高等植物Rubisco的组装及其中间产物的鉴定

将新鲜制备的不含Ｒｕｂｉｓｃｏ的水稻叶片低分子量蛋白组分在离体条件下于室温保温４８ｈ，ＮＤＰＡＧＥ分析发现在ＡＴＰ５ｍｍｏｌ／Ｌ和Ｍｇ２＋５ｍｍｏｌ／Ｌ的作用条件下，在分子量为５６０ｋＤ位置上有一蛋白带生成。高浓度的Ｋ＋在一定程度上抑制它的形成，在保温介质中没有ＡＴＰ存在时，不能产生５６０ｋＤ分子量的条带，但有一更高分子量（约６００ｋＤ）蛋白条带的产生，这一条带能在ＡＴＰ和Ｍｇ２＋作用下发生解离。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＳＤＳＰＡＧＥ分析证实在ＡＴＰ和Ｍｇ２＋存在的情况下，组装成的蛋白确实是Ｒｕｂｉｓｃｏ全酶；而６００ｋＤ的蛋白是由Ｒｕｂｉｓｃｏ大小亚基和ｃｐｎ６０的α、β亚基组成的一个复合物，用３５ＳＭｅｔ同位素标记的水稻Ｒｕｂｉｓｃｏ小亚基前体通过跨膜运输与豌豆叶绿体中的大亚基进行异源重组后，发现除了组装成的异源Ｒｕｂｉｓｃｏ杂合酶外，还发现存在有多种组装中间体。根据这些中间体分子量的测定，推测了高等植物Ｒｕｂｉｓｃｏ在ｃｐｎ６０和ｃｐｎ１０作用下完成组装的可能途径。

早孕因子的生物学特性及其在动物繁殖领域中的应用

早孕因子(early pregnancy factor,EPF)最初发现于孕鼠血清,是妊娠哺乳动物血清中存在的一种具有免疫抑制和生长调节作用的妊娠相关蛋白。EPF的氨基酸序列包括102个氨基酸残基,与伴侣蛋白10(chaperonin 10,Cpn10)高度同源,是Cpn10在细胞外发挥的效应,对温度、酸碱度的耐受性较强,无动物及品种特异性。其生物学特性主要体现在抑制免疫和生长调节两方面:①EPF具有抑制母体的免疫反应而使精子、胚胎免受免疫排斥的作用,也是目前最早确认妊娠的生化标志之一;②EPF能促进肿瘤细胞的生长,也能促进烧伤、溃疡等伤口的愈合。由于EPF能增强抗淋巴细胞血清抑制T细胞花环的形成,因此,玫瑰花环抑制试验是检测EPF活性的经典方法。EPF在动物繁殖领域可用于动物的早期、超早期妊娠诊断,妊娠中断的检测,胚胎移植后的成活情况检测,在评价雄性繁殖力和繁殖免疫疾病的治疗等方面有着重要价值。

肺炎嗜衣原体热休克蛋白10经TLR2及TLR4调控THP-1分泌TNF—α

目的探讨肺炎嗜衣原体（Cpn）热休克蛋白10（HSP10）诱导人单核细胞分泌炎症因子的作用及Toll样受体（TLR）2、TLR4与此作用的相关性。方法制备CpnHSP10（CHSP10）纯化蛋白，去内毒素活性后用不同浓度（0．5、1、5、10、20、30μg/ml）刺激THP-1细胞0、6、12、24、36、48、60h，并比较蛋白不同处理组别中TNF-α的水平差异；以间接免疫荧光及RT-PCR鉴定THP-1细胞上的TLR4及TLR2；分离C3H系野生型和TLLR4缺陷型小鼠巨噬细胞，以CHSP10刺激后检测TNF-α水平；用抗TLR2／TLR4单克隆抗体预孵育细胞，ELISA检测CHSP10刺激细胞前后TNF-α的变化。结果CHSP10刺激THP-1细胞引起上清液炎症因子TNF—α水平显著增加，经加热等处理后蛋白诱生TNF-α的作用明显降低。THP-1细胞可检测到TLR2及TLR4的mRNA及蛋白表达，CHSP10诱生C3H系野生型小鼠细胞分泌的TNF-α明显高于TLR4缺陷型小鼠细胞，TLR2／4经单克隆抗体作用后均可显著降低CHSP10诱导THP-1分泌TNF-α的水平。结论CHSPl0可能作为炎症相关蛋白参与了Cpn对宿主细胞的致炎作用；并且TLR2及TLR4在该炎症刺激信号的传递过程中发挥一定的作用。