miR-455-3p对奶山羊化学诱导乳腺上皮细胞乳脂代谢的影响

【目的】探讨miR-455-3p对奶山羊化学诱导乳腺上皮细胞(CiMECs)乳脂代谢的影响,为研究微小RNA(miRNA)对山羊乳腺功能的调控机制提供理论依据。【方法】利用单一小分子化合物RepSox(TGFβR-1/ALK5抑制剂)诱导山羊成纤维细胞(GEFs),诱导8 d后观察细胞形态变化,采用特异性标记物免疫荧光染色和油红O染色鉴定CiMECs是否诱导成功。使用脂质体将miR-455-3p的过表达载体(miR-455-3p mimics、miR-455-3p mimics-NC)和干扰载体(miR-455-3p inhibitors、miR-455-3p inhibitors-NC)转染至CiMECs,通过细胞增殖及毒性检测(CCK-8)试剂盒、甘油三酯检测试剂盒、实时荧光定量PCR检测miR-455-3p对于CiMECs的增殖率、甘油三酯分泌情况及乳脂代谢基因表达量。【结果】GEFs诱导8 d后形成类似于山羊乳腺上皮细胞的岛状、多核和鹅卵石状细胞形状。免疫荧光结果显示,CiMECs可表达上皮特异性标志物抗原,包括细胞角蛋白14(CK14)和CK18;油红O染色结果显示,诱导后的细胞具有分泌脂滴的功能。CiMECs转染结果显示,miR-455-3p mimics极显著促进了miR-455-3p的表达(P<0.01),miR-455-3p inhibitors显著抑制了miR-455-3p的表达(P<0.05)。CCK-8及甘油三酯检测结果表明,与对照组相比,miR-455-3p mimics组细胞增殖率、甘油三酯分泌量均极显著降低(P<0.01),miR-455-3p inhibitors组细胞增殖率、甘油三酯分泌量均显著增加(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,诱导后CiMECs中HADHB基因表达量极显著降低(P<0.01);miR-455-3p mimics组HADHB基因表达量极显著升高(P<0.01),miR-455-3p inhibitors组HADHB基因表达量显著降低(P<0.05)。【结论】通过抑制miR-455-3p可促进奶山羊CiMECs增殖,降低脂肪代谢基因HADHB的表达,从而提高山羊奶中脂肪酸含量。研究结果可为后续利用miRNA改善山羊乳品质提供参考。

右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR_4表达的影响

目的:观察右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达影响,探讨其可能机制。方法:将大鼠肾小管上皮细胞复苏后培养,加入10ng/ml脂多糖(LPS),均经培养后分为3组,A组为空白对照组,B组为对照组,加入右美托咪定2.5μg,C组为实验组,先加入阿替美唑10μg后30min加入右美托咪定2.5μg,培养12h,免疫组化法检测TLR4蛋白表达及TLR4mRNA水平,并测定细胞凋亡率。结果:B组应用右美托咪定后,TLR4水平为(45.1±13.5)×103均低于A组、B组(tBA=6.549,tBC=5.660,P<0.05);B组TLR4mRNA相对表达值为0.46±0.02,均低于A组、C组(tBA=27.599,tBC=24.749,P<0.05)。B组使用右美托咪定后,细胞凋亡率为(34.6±7.6)%,均明显低于A组、C组(P<0.05)。结论:右美托咪啶可下调脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达,且右美托咪啶对TLR4的调节与α2AR被激动相关。

山羊乳腺上皮细胞基因转染条件的优化

为了优化外源基因转入乳腺上皮细胞的条件,本研究采用组织块培养法,从山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,通过染色角蛋白和测定生长曲线对其进行了鉴定和检测。然后利用电穿孔法将PEGFPC1载体导入乳腺上皮细胞,分别比较了在不同电压(120、140、160、180、200V)、不同电击时长(5、10、15、20ms)以及2株细胞(GMEC1、GMEC2)的不同代数(第1代、第3代、第5代、第9代)条件下的转染效率,并利用优化条件对山羊乳腺上皮细胞进行人β-防御素3基因转染,经过G418筛选,最终获得单克隆细胞,同时对获得的单克隆阳性细胞进行体外诱导表达,并对诱导产物进行Western blotting鉴定。结果表明,不同遗传背景的细胞对转染效率的影响较小,而第1代培养的细胞转染效率要显著高于传代细胞,乳腺上皮细胞在电压180V、电击时长15ms、电击1次的条件下转染效率最高,优化条件下转染、筛选和扩增后获得稳定表达人β-防御素3蛋白的单克隆乳腺上皮细胞。研究工作为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺特异性表达载体的检测提供参考资料。