拟穴青蟹chh基因近端启动子的功能分析

甲壳动物高血糖激素家族在调控甲壳动物的变态发育、生殖、蜕皮、血糖平衡及体内的渗透压平衡等方面起着重要的作用,甲壳动物高糖激素(CHH)是甲壳动物高血糖激素家族中的重要成员.通过Tail-PCR方法克隆获得拟穴青蟹(Scylla paramamosain)chh基因的近端启动子区序列,从翻译起始位点(ATG)起,共657 bp.生物信息学分析结果显示,转录起始位点位于翻译起始位点(ATG)上游第74个碱基(A),在转录起始位点(A)上游31 bp处存在TATA box;核心启动子区位于-41^+9 bp之间,包含在线软件预测的转录起始位点;潜在的转录因子结合位点包括Oct-1、C/EBPalp、GATA-1、Sp1、Ap-1、NF-κappa B、NF-1、RAP1、HNF-3等;目前获得的chh基因启动子区中没有Cp G岛.成功构建了chh基因4个启动子不同长度片段C1—C4,分别位于-583^+205、-388^+205、-286^+205、-46^+205 bp.含启动子不同长度片段的表达载体瞬时转染HEK293T细胞和Sf9细胞后的活性分析表明,在-286^-46、-583^-388 bp区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点,在-388^-286 bp区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点.

红螯螯虾CHH2基因的表达特征及其在卵巢发育中的功能

为研究高血糖激素基因(CHH)在红螯螯虾卵巢发育中的作用,基于转录组学数据鉴定到红螯螯虾CHH2基因序列,并对其基本特性进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了CHH2在红螯螯虾不同组织和卵巢发育阶段的表达情况。结果表明,CHH蛋白在甲壳类物种中高度保守,同源性高达66.84%。qRT-PCR结果表明,在红螯螯虾的肝胰腺中几乎检测不到CHH2表达,在其他组织均有表达,包括肌肉、鳃、肠、心,且在卵巢中的表达水平最高;另外,CHH2在卵巢发育各个时期(未发育、发育期、快速发育期、成熟期)均有表达,表达水平先升高后降低,在卵巢发育成熟期表达水平最低。此外,在切除单侧眼柄和雌二醇活体注射的红螯螯虾卵巢中,CHH2表达水平显著降低。通过注射体外合成CHH2-dsRNA对红螯螯虾进行RNAi干扰试验,结果显示,卵巢发育重要标记卵黄蛋白原基因(VTG)表达水平显著上升。综上所述,CHH2可能负调控红螯螯虾卵巢发育,研究结果为进一步开发基于RNAi的促性腺成熟技术奠定理论基础。