chiA基因在稻根联合固氮菌E26和NG13中的表达

将带有粘质沙雷氏菌几丁质酶基因 (chiA)的 1 8kbHinfⅠ片段分别克隆到表达载体pKK2 2 3 3和质粒pMC71A上 ,构建成几丁质酶表达质粒pKChiA和pMChiA。将这 2种质粒转化稻根联合固氮菌阴沟肠杆菌E2 6 (EnterobactercloacaeE2 6 )和催娩克氏菌NG1 3 (Klebsiellaoxy tocaNG1 3 ) ,chiA基因在这 2菌株中获得高效表达。对表达产物的细胞定位测定表明 ,几丁质酶不仅存在于细胞周间质和胞内 ,而且还分泌到培养物上清液中。在对数生长后期 ,胞外、胞间质和胞内的几丁质酶活性分布分别为 2 3 %～ 2 8%、45 %～ 5 1 %和 2 1 %～ 3 2 %。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明 ,表达的几丁质酶蛋白分子量为 5 8kD。在受体细胞内 ,质粒pMChiA的稳定性要比质粒pKChiA高。

改进RBB染色法初步筛选几丁质酶基因chiA的表达

对RBB(Remazol Brilliant Blue)底物染色方法进行产几丁质酶细菌的酶活性筛选,应用几丁质胶体平板诱导表达的筛选取得好的效果.粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA在E.coli中的异源表达过程:首先从质粒pMD-chiA(DH5α)中切出含粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA的片段,将其插入到表达载体pET-22b(+)内,构建成几丁质酶表达质粒pET-chiA.然后,转化进入DH5α感受态细胞内,鉴定正确后将pET-chiA质粒转入BL21(DE3)pLysS中进行表达,并进行初步筛选.

Chia-Pet技术与应用研究

特定DNA调控元件之间的长距离染色质接触在基因表达调控中起着关键作用,在理解信号网络和细胞状态时,必须对这些三维(3D)染色质结构中的相互作用进行全局表征。利用成对末端标记序列(Chia-Pet)进行染色质相互作用分析是一种将功能染色质结构转化为数百万个短标记序列的方法。自2009年开发以来,在染色质相互作用分析中具有独特的优势,从而为转录调控的研究提供了新的视角。本文介绍了Chia-Pet的实验方案和数据分析过程,分析了几种常用工具各自的特点和适用范围,帮助研究人员选用合适的方法以获得更可靠的结果。

产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因。同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性。基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a(+)上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质。生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用。因此该蛋白具有一定的生物防治作用。

黏质沙雷氏菌C8-8几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)C8-8中克隆到编码几丁质酶的chiA基因,大小为1 692 bp,推测其编码一条长563个氨基酸的多肽链,分子量约为60 900。同源分析研究结果表明从C8-8中克隆的chiA基因序列与黏质沙雷氏菌株141(DQ 990373.1)和14041菌株(DQ 493896.1)的chiA基因序列相似性最高,达到99%。结构域分析结果表明从C8-8中克隆的chiA基因N末端(23 AA)存在典型的信号肽序列,C端存在另外两个结构域,即PKD区(73 AA)和几丁质酶催化区(387 AA)。采用大肠杆菌表达系统重组表达chiA基因,结果表明重组菌株在几丁质诱导培养基上能产生透明的水解圈。采用SDS-PAGE电泳分析,结果表明chiA重组表达产物的相对分子质量约为60 000,与预测分子量大小基本一致。初步提纯后,生物活性试验结果表明该重组表达产物能水解几丁质,在几丁质培养基上产生透明的水解圈。

长期耕作对农田黑土几丁质降解菌群及酶活性的影响

为揭示长期耕作对农田黑土几丁质降解菌群及酶活性的影响及其驱动因子,以黑土区耕法长期定位试验为平台,采用荧光定量和高通量测序技术研究不同耕作措施(灭茬起垄、免耕、间隔深松和翻耕)下0~40cm土层chiA几丁质降解菌基因丰度、微生物群落结构和酶活性。结果表明:0~20 cm土层,免耕显著提高chiA基因丰度;20~40 cm土层,免耕降低chiA基因丰度、alpha多样性和变形菌门(Proteobacteria)相对丰度,但是增加放线菌门(Actinobacteria)相对丰度。土壤pH、平均重量直径和养分含量显著影响chiA基因丰度和群落结构。与灭茬起垄相比,免耕显著提高0~20 cm土层几丁质酶活性,而间隔深松和深翻显著提高0~40 cm土层几丁质酶活性。结构方程模型模拟发现耕作方式、土壤深度、平均重量直径、土壤有机碳、全氮、全磷、chiA基因丰度和放线菌门相对丰度对几丁质酶活性具有显著直接效应。研究结果为明确黑土区不同耕作措施对土壤几丁质降解的影响提供理论基础。

基于慈竹转录组MYB基因的克隆及胁迫诱导表达

从慈竹笋转录组数据库中克隆出2个MYB基因(Be MYB1、Be MYB2)进行生物信息学分析,探讨其响应脱落酸(ABA)、Na Cl、聚乙二醇6000(PEG 6000)胁迫的机制。结果表明,Be MYB1与Be MYB2基因分别编码632个和338个氨基酸;Be MYB1蛋白属于MYB相关蛋白,与小麦Ta MYB48蛋白聚为一枝,具有2个序列模体(motif);Be MYB2蛋白属于R2R3-MYB蛋白,与毛竹Pe MYB2蛋白、水稻Os MYB18蛋白聚为一枝,具有3个motif。Be MYB1和Be MYB2基因均响应了ABA、Na Cl和PEG 6000,但Be MYB2基因对胁迫的响应能力更强,Be MYB1和Be MYB2基因在响应非生物胁迫时发挥重要作用。

不同恢复方式对退化高寒草甸土壤nifH和chiA微生物群落结构的影响

生物固氮和有机氮降解是土壤有效氮的主要来源,固氮和有机氮降解微生物对土壤氮素供应和地力维持具有重要作用。本研究以青藏高原4种不同利用方式的高寒草甸(未扰动、放牧、围封和围封+补播草甸)为对象,结合荧光实时定量和扩增子测序技术,研究了不同恢复方式对nifH固氮菌和chiA几丁质降解菌基因丰度及其微生物群落结构的影响。结果表明:4种草甸的nifH和chiA基因丰度大小排序为:未扰动草甸>放牧草甸>围封草甸>围封+补播草甸,其中未扰动草甸的nifH和chiA基因丰度分别是其他3种草甸的3.4~6.3倍和3.3~8.3倍;固氮菌α多样性在放牧、围封和围封+补播草甸中显著高于未扰动草甸,而几丁质降解菌的α多样性在未扰动和放牧草甸中最高;放牧显著提高了变形菌的丰度而降低了蓝细菌和放线菌丰度;土壤含水量、养分和植被特征对nifH和chiA的基因丰度和群落结构均有显著影响。与未扰动草甸相比,放牧降低了高寒草甸的固氮和有机氮降解潜力,而10年的围封禁牧和补播植草措施对固氮和有机氮降解功能的改善作用不明显。草甸恢复时应综合考虑功能微生物特征及其影响因素,放牧草甸恢复至未扰动水平可能需要更长的封育时间或者采用更加合理的管护措施。

多重耐药基因cfr在食品动物源大肠杆菌中流行特点的调查

为调查多重耐药基因cfr在我国多个地区食品动物源大肠杆菌中的流行情况及耐药现状,对2014年从广东、山东、江苏等11个省份分离得到的4 702株大肠杆菌,采用PCR和测序方法验证cfr阳性菌株,并通过临床常用药物敏感性测定、脉冲场凝胶电泳分型（PFG E）和Southern杂交定位等方法,确定分离株的耐药表型和cfr基因在大肠杆菌中的传播方式。结果显示,共检出cfr阳性菌株9株,检出率为0.19%。药敏试验结果显示,9株cfr阳性菌株对氯霉素、氟苯尼考、氨苄西林、四环素、多西环素均耐药,对亚胺培南均表现为敏感,对庆大霉素、新霉素耐药率在60%以上,对其他药物耐药率介于10%~50%之间。PFGE结果显示,有2株来自同一养殖场的菌株谱型相似,表明存在克隆传播。Southern杂交结果显示,cfr基因定位于大小为70~400 kb之间的质粒上。上述调查结果表明,多重耐药基因cfr在食品动物源源大肠杆菌中的检出率较低,但在广东地区较为流行。

人转化生长因子β1基因在pET表达系统中的表达

目的：研究人转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）成熟肽基因在大肠杆菌中的表达。方法：利用ｐＥＴ－３ｂ载体，分别从宿主、培养基、诱导时间及转录终止子的距离等方面对ＴＧＦβ１的表达进行了优化。结果：ＴＧＦβ１在大肠杆菌中获得一定程度的表达，并存在于包涵体中。结论：利用ｐＥＴ表达系统，可使ＴＧＦβ１基因在大肠杆菌胞内获得表达。