单抗捕获ELISA法检测禽多杀性巴氏杆菌特异性IgM抗体

本试验采用纯化的鸡IgG和环磷酰胺预处理后,再以亲和层析纯化的鸡IgM免疫BALB/C小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,以间接ELISA法筛选,获得了5株能稳定地分泌抗鸡IgM(μ链)特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA交叉反应性试验和羊抗鸡IgM(μ链)抗血清阻断试验,证明这5株单克隆抗体均是抗鸡IgM(μ链)特异性的。应用该抗鸡IgM(μ链)单克隆抗体建立了检测鸡抗多杀性巴氏杆菌血清中特异性IgM抗体的抗体捕获ELISA(Mac-ELISA),本法具有很高的特异性和良好的重复性。用于检测鸡抗多杀性巴氏杆菌的特异性IgM抗体发现:鸡在注射免疫接种多杀性巴氏杆菌灭活菌苗后,第4天即可检测到IgM抗体,并且上升较快,峰值在第2周,滴度较高(1∶5120);鸡在口服免疫接种多杀性巴氏杆菌弱毒活菌苗后IgM抗体上升缓慢,峰值在第4周左右,滴度较低(9∶320);鸡由不同途径感染不同的多杀性巴氏杆菌强毒后第8天时,IgM抗体滴度均明显上升。我们认为,Mac-ELISA方法是检测鸡抗多杀性巴氏杆菌特异性IgM抗体的良好方法,本项试验方法对建立检测鸡抗其它病原微生物的特异性IgM抗体方法具有借鉴意义。

鸡免疫球蛋白MFc(IgMFc)重链的分离纯化及其抗血清的制备

经硫酸铵盐析沉淀并经 DEAE_(32)—纤维素枉色谱分离粗制 IgM,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进一步分离纯化鸡血清 IgM。然后用木瓜蛋白酶水解IgM,经 DEAE_(32)—纤维素柱色谱纯化 IgMFc 重链,再用 IgMFc 重链免疫家兔制取兔抗鸡 IgMFc 重链抗血清。

抗鸡IgM单克隆抗体的研究──Ⅱ．检测抗鸡IgMμ链单克隆抗体的间接ELISA法

采用饱和硫酸铵盐析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２００柱层析和羊抗鸡ＩｇＭμ链抗血清亲和层析等方法从鸡血清中纯化ＩｇＭ，同时采用硫酸钠盐析及ＤＥＡＥ离子交换层析从鸡蛋黄中纯化ＩｇＧ。以纯化的ＩｇＭ和ＩｇＧ包被酶标反应板，进行双排筛选，建立了检测抗鸡ＩｇＭμ链单克隆抗体的间接ＥＬＩＳＡ法。ＩｇＭ和ＩｇＧ最适包被浓度为１μｇ／ｍｌ，ＨＲＰ－羊抗鼠ＩｇＧ最适工作浓度为１：２０００。从４７８孔杂交瘤细胞中共检出３０孔阳性，阳性检出率约为６．２８％。试验结果表明此方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。

富锗种蛋对其初生雏鸡血清IgG、IgM水平的影响

通过给父母代种鸡饲喂四个不同梯度剂量的Ge-132,以获取富锗种蛋,分组孵化后,各取初生雏鸡100只定为试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组;另取普通种蛋孵出的初生雏鸡100只,设为第Ⅴ组,以作对照。各组再分成两个小组,每小组50只,其中Ⅰ-1、Ⅱ-1至Ⅴ-1小组按常规进行免疫处理;而Ⅰ-2、Ⅱ-2至Ⅴ-2小组则不进行免疫。于1、7、14、21、28日龄时分别采血、检测血清IgG、IgM含量,结果显示:1日龄雏鸡血清IgG、IgM含量Ⅰ～Ⅳ显高于第Ⅴ组,差异极显著(P<0.05);1日龄后,Ⅰ～Ⅳ组抗体水平逐渐下降,至7日龄时,降至低谷并接近对照组;其后,至28日龄间各组雏鸡血清IgG,IgM含量又呈上升趋势,而Ⅰ～Ⅳ组始终高于第Ⅴ组、但差异并不明显(P>0.05);各免疫处理小组与非免疫小组比较,二者间未见明显的、规律性差异。实验结果首次证实:富锗种蛋孵出的雏鸡,其血清IgG、IgM水平明显高于普通雏鸡,尤于1周龄阶段内更为显著。表明Ge-132能明显地提高初生雏鸡的抗体水平。

抗鸡IgM单克隆抗体的研究──Ⅲ．抗鸡IgMμ链单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

以亲和层析纯化的鸡ＩｇＭ免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠为材料，取３次免疫后的脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，用ＥＬＩＳＡ筛选抗鸡ＩｇＭ和ＩｇＧ抗体以确定抗鸡ＩｇＭ重链特异性的抗体，获得了７株分泌抗鸡ＩｇＭμ链特异性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株．命名为Ｍ２、Ｍ４、Ｍ７、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１；和Ｍ１２。这７株杂交瘤细胞株连续传代６个月，并经液氮冻存５个月后复苏培养，仍能稳定地分泌特异性ＭｃＡｂ。７株ＭｃＡｂ均具有ＥＬＩＳＡ特性和免疫沉淀特性，腹水ＥＬＩＳＡ效价均在１０－５以上，其中Ｍ２、Ｍ４和Ｍ１０３株腹水效价高达１０－１０以上，最高者达到１０－１５。琼脂免疫扩散试验和ＥＬＩＳＡ交叉反应性试验测定表明，７株ＭｃＡｂ均与鸡ＩｇＭ呈阳性反应，与鸡ＩｇＧ呈阴性反应。用羊抗鸡ＩｇＭμ链抗血清进行ＥＬＩＳＡ阻断试验，结果表明，７株ＭｃＡｂ均是抗鸡ＩｇＭμ链的ＭｃＡｂ。

抗鸡IgM单克隆抗体的研究Ⅰ．亲和层析纯化鸡IgM

采用硫酸铵盐析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２００柱层析和亲和层析技术从鸡血清中提纯ＩｇＭ。经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，纯化的ＩｇＭ达到电泳纯，其重链分子量为８００００道尔顿，轻链分子量为２２５００道尔顿。在双向琼脂免疫扩散试验中，能与羊抗鸡ＩｇＭμ链抗血清产生一条清晰的免疫沉淀线。免疫鸡与非免疫鸡比较，发现前者血清中ＩｇＭ含量为后者的２倍以上。

日粮高铜对雏鸡血清免疫球蛋白含量的影响

选用1日龄艾维茵肉鸡健雏420只,随机分为7组,分别喂以对照日粮(Cu11mg/kg)和高铜日粮(Cu100mg/kg,高铜Ⅰ组;Cu200mg/kg,高铜Ⅱ组;Cu300mg/kg,高铜Ⅲ组;Cu400mg/kg,高铜Ⅳ组;Cu500mg/kg,高铜Ⅴ组;Cu600mg/kg,高铜Ⅵ组)6周。结果显示,高铜Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组雏鸡血清免疫球蛋白含量与对照组比较差异不显著(P>0.05);高铜Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组雏鸡血清免疫球蛋白含量显著降低(P<0.05或P<0.01),并与日粮含铜量呈负相关。结果表明,日粮铜含量在400mg/kg及其以上可抑制免疫球蛋白的合成,导致雏鸡体液免疫功能受损。

鸡贫血因子病局部粘膜免疫功能变化的研究

用鸡贫血病毒（ＣＡＶ）感染１日龄ＡＡ雏鸡，以未感染同龄ＡＡ雏鸡为对照，在感染后７，１４，２１，２８，３５，４２，４９日龄检测其哈德尔腺及盲肠扁桃体Ｔ细胞和ＩｇＧ＋、ＩｇＭ＋、ＩｇＡ＋抗体生成细胞数量、泪液、气管液、肠液、胆汁中ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ含量的动态变化。揭示了感染鸡局部粘膜免疫组织哈德尔腺、盲肠扁桃体细胞免疫和体液免疫功能降低，眼部、呼吸道和消化道免疫防御功能减弱。