鸡蛋开窗法导入供体胚盘细胞对家鸡胚胎发育的影响研究

通过 4批孵化实验 ,研究鸡蛋开窗法注射供体胚盘细胞对受体鸡胚发育及孵化率的影响 .GLM方差分析表明 ,开窗处理极显著降低整个孵化期 (2 1 d)的活胚比例 (P<0 .0 1 ) ,至 2 1日龄出壳时 ,处理组的孵化率为 0 .8%～ 6.0 % .导入供体胚盘细胞对受体鸡胚的发育仅为阶段性影响 ,表现在显著降低孵化第 8日龄左右的活胚比例 (P<0 .0 5 ) ,而对后期发育的影响不显著 (P>0 .0 5 ) .因此 ,鸡蛋开窗处理是降低受体胚胎成活率和孵化率的主要原因 。

短双链RNA对鸡胚盘细胞外源绿荧光蛋白基因表达的影响

RNA干扰 (RNAinterference,RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法 ,正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具。为了了解RNA干扰在禽类中的作用情况 ,实验将体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA (siGFP)和 3 磷酸甘油醛脱氢酶短双链干扰RNA (siGAPDH )分别同绿荧光蛋白(Greenfluorescentprotein ,GFP)表达载体 (pEGFP C1Vector)用脂质体转染试剂LipofectamineTM2 0 0 0共转染鸡胚盘细胞 ,并于转染后 36h在荧光显微镜下观察转染和干扰效果。对细胞绿荧光蛋白表达率的方差分析结果显示 ,不同处理组间差异达极显著水准 ,其中GFP组和GFP +siGAPDH组均同GFP +siGFP组差异极显著 ,GFP组同GFP +siGAPDH组差异不显著。实验结果说明 ,siGFP能特异、有效地敲低细胞绿荧光蛋白的表达。同线虫、真菌、拟南芥、水螅、锥虫、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等其它生物体一样 ,鸡胚盘细胞中也存在短双链干扰RNA (siRNA)

鸡Ⅹ期胚盘细胞体外培养

为证实经遗传修饰的鸡X期胚盘细胞具有参与受体胚胎发育和形成嵌合体的能力 ,本研究将由鸡X期胚盘制成的细胞悬液与经脂质体包埋的抗鸡传染性支气管炎病毒基因重组质粒PGS1共孵育后 ,直接显微注入同期受体胚盘 (14 0枚 ) ;或对转染后供体细胞进行G418抗性筛选后显微注入同期受体鸡胚盘 (14 0枚 ) ;或将供体细胞体外培养 4 8h ,再与脂质体 PGS1复合物共孵育后显微注入同期受体鸡胚盘 (190枚 ) ,制备转基因嵌合体鸡 ,并应用PCR和RAPD方法 ,对鸡胚和雏鸡不同组织或血液中的DNA进行检测。结果表明 :直接注射组孵化率(5 7% )显著 (P <0 0 1)高于G418筛选处理组 (1 4 % )和培养 4 8h处理组 (2 1% ) ;G418筛选处理组不同胚龄鸡胚组织、器官中外源DNA的PCR检测阳性率均高于其它二个组。实验结果证明 ,体外培养 4 8h并经遗传修饰的胚盘细胞仍然具有形成嵌合体的能力 ,利用早期胚盘细胞途径制备转基因鸡是可行的。

鸡Ⅹ期胚盘细胞分散培养与整胚培养比较初探

为比较鸡Ⅹ期胚盘细胞分散培养与整胚培养效果,对鸡Ⅹ期胚盘细胞分别进行分散培养和整胚培养并进行传代,观察细胞生长情况,通过碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定计算阳性克隆率;结果,分散培养的细胞生长状态良好,整胚培养的细胞贴壁能力较差,培养过程中细胞易分化;传代后两种方法培养的细胞AKP阳性克隆率差异显著(P<0.01)。表明鸡Ⅹ期胚盘细胞分散培养效果较为理想。

逆转录病毒转染胚盘细胞制备嵌合体鸡胚的研究

【目的】通过重组逆转录病毒体内感染源于第X期胚盘细胞的方法获得嵌合体鸡。【方法】将扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的开放阅读框插入逆转录病毒表达载体pour-pBabe中获得重组逆转录表达载体;采用磷酸钙转染法将其与包装载体pVSVG共转入29310A1包装细胞中进行病毒包装,得到病毒原液经超速离心浓缩200倍后注入种蛋(第X期)胚盘下腔,孵化种蛋。提取孵化5.5天的鸡胚基因组DNA,进行PCR检测和Southern杂交检测。【结果】构建含EGFP完整开放阅读框的逆转录病毒表达载体pour-pBabe-EGFP,提取孵化5.5d鸡胚基因组DNA,经PCR、Southern杂交检测,嵌合体阳性率分别为75%和66.7%。【结论】通过用重组逆转录病毒体内感染鸡胚盘细胞的方法可获得嵌合体鸡。

利用Gateway技术构建慢病毒载体及其在鸡囊胚细胞中的表达

目的:建立慢病毒载体介导的外源基因在动物中表达的模式。方法:通过PCR扩增出带EGFP基因和特异性结合位点的DNA序列,并应用Gateway技术构建了带EGFP基因的pLenti6/v5-DEST慢病毒载体。利用磷酸钙介导慢病毒4质粒系统在包装细胞中转染,收集并浓缩产生的病毒颗粒,通过感染293FT细胞测定慢病毒滴度。结果:通过PCR扩增后测序分析,表明慢病毒载体构建正确。病毒滴度测定结果为2×107TU/mL。并用慢病毒对鸡囊胚细胞进行感染,获得了较强的表达效果。结论:慢病毒载体系统所产生的病毒颗粒对动物细胞具有较强的感染能力,为慢病毒载体在转基因家禽研究中的应用奠定了基础。

鸡BCs原代培养贴壁性影响因素分析

试验从鸡第X期胚胎中分离囊胚,使用含10%FBS、青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基,对鸡X期BCs进行无饲养层培养。分别在6h、12h、24h对细胞贴壁性进行评价,探究分离方法、离散程度、培养细胞密度、离心损伤对细胞培养的影响。结果表明:滤纸环法在分离胚胎上效果最好;细胞离散程度上,吹打20下效果最好,与吹打30下差异不显著(P>0.05),二者与吹打40下差异均显著(P<0.05);接种密度上,1×103个/mL和5×103个/mL两组差异不显著(P>0.05),这两组与其它组,以及其它组之间差异均显著(P<0.05),密度为1×105个/mL时效果最好,5×104个/mL次之,但密度为5×104个/mL时更方便观察;离心处理上,都离心5 min的条件下,5 590×g和1 398×g组差异不显著(P>0.05),但其与224×g处理组差异显著(P<0.05),其中5 590×g组效果最佳。因此,滤纸环法分离胚胎,吹打20下离散细胞,使用5 590×g离心5min,稀释成5×104个/mL的密度,接种到96孔板培养,可以获得较好的结果。

DNA探针鉴定转基因鸡早期性别

质粒ｐＵＧＤ１２０１经扩增、提取、纯化、酶切等一系列过程而获得了Ｗ染色体特异性ＤＮＡ片段，继而获得用地高辛标记的Ｗ染色体ＤＮＡ探针。用该探针通过原位杂交法对鸡Ｘ期胚盘细胞成功地进行了性别鉴定。

鸡囊胚细胞嵌合体制作技术研究及其应用前景

家鸡X期囊胚细胞(BCs)嵌合体技术,既是利用转基因技术进行家鸡品种改良和凭借转基因家鸡生物反应器生产医用蛋白等研究领域的关键技术,也是利用BCs冻存家鸡和珍稀鸟类双亲种质资源实现鸟类品种资源多样性保护、利用和挽救珍稀濒危鸟类的重要途径。从家鸡BCs嵌合体制作技术的基本过程:(1)羽色嵌合体家鸡模型的建立;(2)囊胚的分离与消化;(3)受体种蛋的致弱处理;(4)受体种蛋的开窗(包括部位、方法及封口技术等);(5)供体细胞导入受体胚(显微注射或简易操作);(6)孵化(常规方法或换壳培养)等几个方面的研究进展、目前存在的问题以及研究方向等进行了系统阐述。

用BRL-3A条件培养基培养鸡胚胎干细胞的初步研究

以CEF细胞、MEF细胞和STO细胞为饲养层,用BRL-3A条件培养基培养寿光鸡Ⅹ期胚盘细胞,并对获得的细胞克隆进行了鉴定,证明其具有ES细胞的克隆形态、PAS染色阳性、AKP染色阳性、能分化为多种类型的细胞、能参与受体胚胎的发育并形成羽色嵌合体。实验结果表明:BRL-3A条件培养基能促进鸡ES细胞克隆的形成,用饲养层比不用饲养层更有利于克隆的形成,且STO细胞和MEF细胞饲养层的培养效果要好于CEF细胞饲养层(P<0.05);挑克隆传代法比全消化法更有利于克隆的形成和未分化状态的维持(P<0.05)。

鸡胚胎干细胞的体外培养和鉴定

从鸡X期胚胎中分离胚盘细胞,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)为滋养层,高糖DMEM为基础培养基并添加10 ng/mL bFGF、20 ng/mL hIGF-1、2 ng/mL mSCF、2 ng/mL hIL-11和1 000 U/mL LIF等细胞因子对细胞进行培养,获得典型的呈集落生长的鸡胚胎干细胞(chicken embryonic stem cells,cESCs)克隆。免疫组化显示,呈集落生长的cESCs克隆具有较高的内源性AKP活性并表达多能性标志SSEA-1和Oct-4。RT-PCR分析进一步证实其表达cESCs特异性基因cENS-1。结果表明,该培养体系可用于cESCs的分离并维持其在体外生长并保持未分化状态。

鸡Ⅹ期囊胚细胞研究进展及其应用

鸡Ⅹ期囊胚细胞(Blastodermal cells,BCs)作为潜在的胚胎干细胞,在胚胎发育动物模型、禽类转基因技术以及家禽种质资源冷冻保存等方面有广阔的应用前景。文章对鸡BCs的形态特征、体外培养、诱导分化、遗传修饰、冷冻保存、性别鉴定等体外操作方面的研究与应用进行了综述。

鸡囊胚细胞DMSO细管冷冻保存技术研究

旨在研究高效鸡囊胚细胞(Blastodermal cells,BCs)冷冻保存技术,为利用BCs保存禽类雌性遗传资源以及胚胎干细胞研究奠定基础。采用解冻后二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate,FDA)染色以及培养24h后细胞贴壁率双重检测BCs活力方法,比较二甲基亚砜(DMSO)不同浓度、不同冷冻与解冻速率等对BCs的冷冻保存效果。结果表明:(1)DMSO不同浓度,20%组解冻后活力最高(0.58),与15%组差异不显著(P>0.05),但与5%、10%和25%组差异极显著(P<0.01);细胞复苏后贴壁率,20%组最高(30.5%),与15%组差异不显著(P>0.05),与25%组差异显著(P<0.05),与5%和10%组差异极显著(P<0.01)。(2)冷冻速率,使用三步法冷冻,以-1℃·min-1的速率降温至-7℃,保持10min,继续降温分别至-15、-35、-55、-75℃后,投入液氮中保存,-75℃组解冻后活力最高(0.53),但与-35℃、-55℃组差异不显著(P>0.05);贴壁率,各组间差异极显著(P<0.01),其中-35℃组最高(36.6%)。(3)37℃水浴解冻,10s、1min、2min、3min解冻后,各组间活力差异不显著(P>0.05),其中10s组最高(0.60),解冻后贴壁率,37℃水浴1min组结果最好(43.9%),与水浴2min组差异不显著(P>0.05),但与水浴10s组差异显著(P<0.05),与水浴3min组差异极显著(P<0.01)。50℃水浴5s、20s、40s、1min解冻,5s组活力最高(0.70),与20s组差异显著(P<0.05),与40s、1min组差异极显著(P<0.01),解冻后贴壁率,各组间差异均极显著(P<0.01),其中50℃水浴5s组最高(36.9%),50℃水浴1min组最低(5.6%)。综上表明,鸡BCs使用DMSO浓度为20%的冷冻保护剂进行细管冷冻,以-1℃·min-1的速率降温至-7℃保持10min,继续以此速率降温至-35℃后,投入液氮保存,37℃水浴1~2min解冻,BCs通过FDA染色与体外培养贴壁率双重检测均可获得较好效果。

明胶对鸡胚盘细胞的增殖和多功能性的影响

[目的]本试验旨在解决鸡胚盘细胞(c BC)不易贴壁的问题及应用E8培养基建立新的鸡胚盘细胞培养体系。[方法]在E8培养基基础上,应用10 g·L^(-1)明胶和人重组玻连蛋白(h VTN)包被培养板,对比其在促进鸡胚盘细胞贴壁速度、促进增殖和维持多功能性方面的差异。[结果]使用10 g·L^(-1)明胶包被培养板后,鸡胚盘细胞12 h内即可迅速贴壁。10 g·L^(-1)明胶处理组中5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)阳性细胞率显著高于对照组(P<0.01),并且能够抑制凋亡基因P21、Fas的mRNA表达(P<0.05),进而促进细胞增殖,并且能够促进多功能基因Nanog、PouV的表达来维持c BC的多功能性。[结论]10 g·L^(-1)明胶可以作为一种新的包被试剂来进行cBC的培养,与人重组玻连蛋白相比,明胶体现了更高的性价比,具有较高的应用价值。

鸡囊胚细胞冷冻损伤的评价方法

采用滤纸环法分离鸡囊胚细胞(blastodermal cells,BCs),冷冻复苏后使用二乙酰荧光素(fluorescein diacetate,FDA)测定细胞活率,以及培养24h测定细胞贴壁率简称"贴壁率法",探究2种方法在不同冷冻程序优化试验中对细胞冷冻损伤的评价效果。结果显示,FDA染色法与贴壁率法在冷冻保护剂浓度优化、冷冻及解冻速率优化试验中对细胞冷冻损伤的评价结果差异不显著(P>0.05),相关性很好,但也有一定差异;不同冷冻剂浓度优化试验中,5%DMSO冷冻保护液有细胞活率,但无贴壁现象;投入液氮温度对比试验中,-35℃以后,随着投入温度的降低,细胞活率略微升高,但贴壁率呈较明显的下降趋势。因此,2种方法均适合鸡BCs冷冻损伤评价,但贴壁率法能给出更多关于细胞状况的信息,评价结果更加真实可靠。

不同抗氧化剂对鸡胚盘细胞冷冻效果的影响

为探究不同抗氧化剂对鸡胚盘细胞(blastodermal cells,BCs)冷冻保存效果,试验在冷冻液中分别添加不同浓度的N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和番茄红素(lycopene,LP)3种抗氧化剂,用胚胎程序冷冻仪冻存BCs,解冻后测定细胞活率(简称"活率"),并于培养24h后测定细胞贴壁率(简称"贴壁率")。结果表明:在活率上,除了0.05mol/L NAC组(76.7%)与800U/mL CAT组(77.3%)极显著低于对照组外(P<0.01),其余各组与对照组差异均不显著(P>0.05);在贴壁率上,除了800U/mL CAT组(34.2%)极显著低于对照组(P<0.01)外,其余试验组均极显著高于对照组(P<0.01),其中NAC、CAT与LP的最佳浓度,分别为0.01mol/L(48.3%)、200U/mL(45.4%)与0.05g/L(39.8%)。因此,在冷冻液中添加适量的NAC、CAT或LP,可以提高BCs冷冻保存活率(差异不显著),极显著提高解冻BCs培养24h后的贴壁率。