Ⅰ型鸭肝炎病毒鸡胚致弱毒MY株的培育及实验研究

将Ⅰ型鸭肝炎分离株XC-1适应鸡胚,培育成1株毒力弱而稳定、免疫原性良好的鸭肝炎鸡胚化MY弱毒株。该毒株毒力为1011.40ELD50/0.1mL,1013.62TCID50/0.1mL;对雏鸭无致病性;在雏鸭体内连续盲传5代未见毒力返强;1日龄雏鸭用8,000 ELD50/0.1mL的MY株致弱毒腿部肌注0.2ml免疫后3d强毒原液0.5mL/只攻击,可产生2/5的保护,第6d-21d产生完全保护,免疫后第3d、5d、6d、7d、9d、14d、21d抗DHVⅠ的中和抗体滴度分别为10-1.38、10-1.55、10-1.64、10-1.65、10-1.68、10-1.8、10-1.89,表明MY是1株理想的鸡胚弱毒疫苗后备株;通过MY株的鸡胚的繁殖规律观察,确定该病毒的最佳收毒时间为接胚后的72h^84h,为疫苗生产条件的建立提供了依据。

Ⅰ型鸭肝炎病毒(MY株)活疫苗毒种的纯粹及生产条件探索

将Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株进行纯粹检验；以100ELD50 0．2mL／枚（含病毒3．0×10^5个拷贝）剂量经鸡胚尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每隔12h观察并采集鸡胚胚体和尿囊液样本，运用自行建立的检测DHV-1的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法检测MY株弱毒的鸡胚增殖规律．结果表明，该毒种符合我国的兽用生物制品规程，毒种纯粹；病毒接种后，鸡胚死亡时间主要集中在48-53h；病毒在感染后的12h，24h，36h，48h和53h时段，鸡胚尿囊液中病毒拷贝数为：3．28×10^2、5．28×10^3、7．01×10^3、3．31×10^5和4.42×10^5；鸡胚胚体病毒拷贝数为：8．46×10^3、1．91×10^6、3．41×10^6、1．36×10^7和1．03×10^7;显示，MY株弱毒经鸡胚尿囊腔接种鸡胚，病毒在胚体中的拷贝数在各时间均高于尿囊液中的拷贝数，且在48-53h达到高峰（1．36×10^7-1．03×10^7）．因此，用鸡胚繁殖MY株弱毒，应以收获鸡胚胚体为主要毒源，收毒时间以鸡胚尿囊腔接种后48～53h为佳．为运用MY株生产Ⅰ型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗奠定了基础．

鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验

将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Vp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果。结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45;雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用。首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力。

雏鸭人工接种鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY后组织结构动态变化的比较研究

对鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY接种4日龄雏鸭后的组织变化进行了动态观察比较研究。结果显示:雏鸭接毒12 h肝、肾呈现轻度细胞变性;48 h后组织变性程度减轻,汇管区周围细胞增生;144 h细胞核、浆染色加深,组织修复迹象明显;14 d结构正常。接毒12 h脾脏白髓、法氏囊滤泡中淋巴细胞减少,72 h脾、24 h法氏囊中淋巴细胞有所增多。心脏、肺、脑组织在接毒各期皆有轻度的充血、出血。鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY与标准毒导致的多组织变性、坏死相比,其变性轻而可逆;与疫苗HY所致的组织变化相似,但结构恢复时间早。结果表明:鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY接种4日龄雏鸭,虽可造成雏鸭肝、肾等实质器官轻微的组织病变,但损伤的组织结构可在短期内修复,并恢复至正常;脾脏、法氏囊中的淋巴细胞在接毒后,也由减少到增多。本研究为鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY用作鸭肝炎疫苗株的安全性从病理组织学角度提供了依据。

雏鸭接种Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株后血清生化指标的动态变化

用Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株人工接种4日龄雏鸭，于接种后第6、12、24、48、72、96、144、168、192h及14d采集接种鸭的血液，分离血清，进行生化指标测定，并与同期接种的弱毒疫苗HY、标准毒及对照组的血清生化指标进行比对。与对照组比较：MY组和HY组的白蛋白在接种后24h明显降低，48h差异极显著；血清谷丙转氨酶于24h、144h时段明显升高，且MY组持续至192h。标毒组则表现为接毒后，血清葡萄糖于24～96h降低，甘油三酯于72h、192h显著升高；血清总蛋白72h、96h、144h，白蛋白24—144h，球蛋白72～96h，144h明显降低；谷丙转氨酶于24～192h，血清谷草转氨酶在24～72h显著升高；尿酸72h呈一过性升高。结果表明，感染Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株与弱毒疫苗HY的血清生化变化规律相似。

鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株的选育

【目的】将鸭坦布苏病毒BZ_2010株在SPF鸡胚上进行连续传代致弱;旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以SPF鸡胚为增殖宿主,将BZ_2010株连续传代,直至第120代;以1日龄雏鸭和30周龄的产蛋种鸭为试验对象,对第120代次毒株(命名为VC2)的安全性进行评价;以1d雏鸭为试验对象,对VC2株的返强情况进行评价;以18周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的中和抗体进行监测;以25周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的保护效果进行评价;利用RT-PCR方法分别扩增BZ_2010株和VC2株的E基因和N54A基因,进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐缩短,而病毒毒价有逐)渐提高的趋势,ELD_(50)由第20代的10^(-5.3)/0.1 mL提高到第120代的10^(-5.8)/0.1mL,而且第80代之前提高较快,后期基本稳定。将VC2株通过颈部皮下接种1d雏鸭和肌肉接种30周龄产蛋种鸭,接种后试验鸭无异常临床表现,肝脏也无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的安全性。将VC2在1d雏鸭进行连续5次传代,未发现试验鸭有任何异常症状,将第5代组织悬液接种1d雏鸭,采集肝脏进行病理切片观察,发现无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的稳定性。基因测序分析结果显示,VC2株E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸发生改变,而NS4A蛋白只有一个氨基酸发生突变,即第54位氨基酸由F变为L。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,第4周即可达到高峰,并且维持较长时间;VC2免疫后于第2周和第50周利用强毒株进行攻毒试验,结果VC2免疫组在攻毒后未出现异常症状,粪便正常,产蛋率保持正常,这说明VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。【结论】通过鸡胚连续传代成功获得了一株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,可维持较长时间。攻毒试验结果表明,VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。

血清3型鸭甲型肝炎病毒弱毒疫苗株培育及免疫原性研究

近年来鸭甲型肝炎病毒血清3型引起的小鸭肝炎在我国广泛流行,严重危害着肉鸭养殖业。本研究采用鸭胚连续传代对血清3型鸭甲型肝炎病毒分离株进行致弱,通过检测不同代次的鸭胚组织毒的毒力、稳定性及免疫原性,结果发现该病毒在鸭胚中连续传代至第53代以后对雏鸭无致病性,在雏鸭体内连续继代不出现毒力返强。雏鸭经颈部皮下接种5×105.9ELD50的第54代病毒后可刺激机体产生坚强的免疫力。1日龄雏鸭免疫后4 d对强毒感染的保护指数为81.4%,免疫后6天的保护指数为100%。3日龄雏鸭免疫后5 d攻毒保护率为100%。1日龄雏鸭免疫后1周,血清中和抗体水平为10-3.29,至第4周达到高峰,之后开始缓慢下降。试验结果表明,3型鸭甲型肝炎病毒株第54代弱毒具有良好的免疫原性、毒力稳定,雏鸭接种后诱导产生的免疫力完全可以保护小鸭渡过鸭肝炎易感期。

鸭瘟鸡胚化弱毒株细菌人工染色体的构建与鉴定

为了构建鸭瘟鸡胚化弱毒株DEV(atten)的细菌人工染色体(BAC),将转移载体质粒pDEVgC-pHA2DNA和DEV(atten)DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行重组,通过三轮挑斑纯化,以获得纯化的鸭瘟重组病毒。将纯化的鸭瘟重组病毒的DNA电转化到E.Coli DH10B中,对获得的克隆用酶切、PCR方法进行鉴定并测序。提取阳性克隆的DNA转染CEF,以拯救重组病毒。再通过将带有相同同源臂和UL44(糖蛋白质C,gC)基因的片段和阳性克隆的DNA共转染鸡胚成纤维细胞进行重组,以获得gC恢复病毒。采用0.01感染复数(MOI)感染CEF对亲本病毒、恢复病毒进行多步法生长曲线测定,比较其有无差异。结果显示:成功获得了DEV的mini-F重组病毒,命名为DEV(atten)-mini-F,获得2个阳性克隆S1、S2,将S1命名为pDEV(atten),应用pDEV(atten)拯救重组病毒获得gC恢复病毒DEV(atten)ΔgC-R,生长特性的结果显示亲本病毒与恢复病毒间无显著性差异。表明成功构建的DEV(atten)的细菌人工染色体为全基因组的感染性克隆。

1株基因3型鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒株的培育

为研发基因3型鸭甲肝病毒(Duckhepatitis virustype3,DHAV-3)的弱毒活疫苗,用SPF鸡胚对DHAV-3Y株进行了连续传代致弱,由此获得第80代鸡胚适应毒。致病性试验结果显示,第80代毒株对1日龄雏鸭已无致病性。免疫攻毒保护试验显示,雏鸭在1日龄时经肌肉注射途径免疫第80代鸡胚适应毒,能有效抵抗7日龄时的强毒感染,保护指数为100%。表明第80代鸡胚适应毒是一株具有良好免疫原性的鸡胚化弱毒疫苗候选株。

鸡传染性法氏囊病野毒株的分离鉴定及河北弱毒株培育的研究

从河北省６个地区鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）的鸡群中，分离到６株强毒，均能使易感鸡３６小时发病并死亡，发病率达６０～１００％，死亡率１０～７０％。人工感染鸡能见到与野外病例相同的病变。经血清学试验、鸡胚接种、电镜观察均证明，分离物为传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ），其中有的毒株，毒力非常强。利用其中毒力最强的１株病毒，经鸡胚多次传代培养育成１株免疫原性好，免疫期长，免疫效果容易监测的弱毒株，经野外试验证明，该毒株是防治ＩＢＤ的一个很理想的毒株。

一株鸭肝炎弱毒在鸭胚肾单层细胞上增殖特性的研究

本文介绍８个鸭肝炎毒株在鸭胚肾细胞上连续传５代的情况，发现其中一弱毒株Ｅ２８从第一代即产生了明显的细胞病变，在传代过程中细胞病变稳定地出现。本文还用起薄切片技术、免疫荧光试验和细胞培养物提纯病毒的电镜观察。

鸭肝炎病毒A66弱毒株的水平传播感染

取10倍免疫剂量的鸭肝炎弱毒活疫苗(A66株),分别经皮下注射和口服途径接种1日龄易感雏鸭20只,5 d后每组取出接种鸭10只分别与20只1 d龄易感雏鸭共同饲养进行第1代同居感染试验,5 d后取第1代同居感染试验鸭10只再与20只1 d龄易感雏鸭共同饲养进行第2代同居感染试验,如此进行5次同居感染试验。定时采集各代次同居感染试验鸭的泄殖腔内容物进行PCR检测,测定鸭肝炎病毒A66弱毒株水平感染能力和排毒情况,并通过对各代次同居感染试验鸭的攻毒试验,测定水平感染的免疫保护作用。结果表明:鸭肝炎弱毒活疫苗(A66株)经皮下注射和口服途径接种雏鸭,均可以通过粪便向体外排泄病毒;同居易感雏鸭可接触感染,感染的雏鸭可获得一定的免疫保护作用;但这种同居感染能力随着同居代次的增加而逐渐减弱,至5代时基本终止。试验结果表明A66毒株可引起雏鸭间的水平传播感染,但这种水平传播能力有限,不会引起毒力返强。

基因A型鸭甲肝病毒弱毒株免疫雏鸭的8种细胞因子mRNA变化分析

为研究基因A型鸭甲肝病毒(DHAV-A)MY弱毒株对雏鸭细胞因子表达的影响,阐明细胞因子在DHAV-A弱毒疫苗免疫中的作用,利用荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法,检测DHAV-A MY弱毒株接种1日龄SPF雏鸭后0.25、0.5、1、2、3和5d共6个时间点肝、脾和脑组织中IFN-α、IFN-β、IFN-γ,以及IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α共8种细胞因子的mRNA转录水平,并结合各时间点DHAV-A的荷载量进行分析。结果表明:肝和脑组织中2d时间点以及脾组织中3d时间点病毒荷载量达到最高;三种组织中,8种细胞因子的转录水平均随着病毒荷载量的增加而升高,且在各组织病毒荷载量最高时间点,8种细胞因子的转录水平均极显著升高(P<0.01),结果证明DHAV-A MY弱毒株可刺激雏鸭抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α以及炎性细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8mRNA的转录,本研究丰富了DHAV-A MY弱毒株的免疫机制。

鸭胚肾细胞用于鸭肝炎弱毒增殖的研究

为分析鸭胚肾细胞用于鸭肝炎病毒增殖的可能性,从鸭胚肾细胞的制备、体外培养、鸭肝炎弱毒在鸭胚肾细胞中的增殖等方面入手,初步分析了鸭胚肾细胞体外培养和用于鸭肝炎病毒增殖的可行性。结果表明,鸭胚肾细胞能够体外培养并形成良好的细胞单层,形态多为多边形或梭形;原代鸭胚肾细胞可以用于增殖鸭肝炎弱毒A66株,毒价(ELD50)达10-4.2/0.2 m L。说明鸭胚肾细胞适合用于鸭肝炎病毒的增殖,有望用于鸭肝炎病毒疫苗的生产。

DHAV-3适应鸡胚毒株的培育及特性测定

旨在培育鸭甲型肝炎病毒血清3型(DHAV-3)适应鸡胚毒株并对其特性进行研究。利用鸭胚从临床病料中分离得到的DHAV-3 LC强毒株经卵黄囊接种鸡胚传代、纯化获得适应鸡胚毒株,并对毒株的致病性、毒力稳定性、免疫原性和基因组特征进行测定。结果显示,利用鸭胚接种成功从病料中分离鉴定DHAV-3 LC强毒株,对鸭胚和雏鸭的半数致死量分别为10-6.20/0.2 mL和10^(-4.25)/0.2 mL。经卵黄囊接种鸡胚69代,获得适应鸡胚毒株DHAV-3 CA。CA株的F4、F16、F21、F31、F41和F51代病毒液的ELD50分别为10^(-6.44)/0.3 mL,10^(-6.60)/0.3 mL,10^(-7.44)/0.3 mL,10^(-7.80)/0.3 mL,10-7.43/0.3 mL和10^(7.25)/0.3 mL;各代病毒对1日龄雏鸭不致病,但在体内连续传代出现接种雏鸭死亡。F21代病毒制备的油包水灭活疫苗免疫蛋鸡,血清中和抗体效价达1∶500以上;以2.5×10^(4.8)ELD50及以上剂量的F31代病毒经颈部皮下接种1日龄雏鸭,攻毒保护率均在90%以上。F21代病毒全基因组序列分析显示,与DHAV-3 LC相比,基因组内无碱基插入或缺失,但有32个位点发生碱基突变;VP0基因的C1410T和A1411G突变与病毒在鸡胚中的传代次数有相关性。本试验成功培育出适应鸡胚毒株DHAV-3 CA,具有良好的免疫原性,但存在致病性返祖现象。