Adaptability of Fowlpox Virus in Chicken Embryo Passage Cells

[Objective] To observe whether fowlpox virus （FPV） can proliferate in chicken embryo passage fibroblasts or not and then try to use chicken embryo passage fibroblasts to replace primary chicken embryo cells for FPV culture. [Method] Primary chicken embryo fibroblasts were prepared and subcultured. After FPV were inoculated on the 20th passage fibroblasts, cytopathy was observed. Then, the FPV culture was identified and determined quantificationally. [Result] Specific cytopathy appeared in the FPV-inoculated chicken embryo passage fibroblasts. The titer of the yielded FPV culture reached the standard for production of fowl pox vaccine. Further analysis reveals that the chorioallantoic membrane lesions were caused by FPV. [ Conclusion] FPV can reproduce in chicken embryo passage fibroblasts, and the Uter of FPV cell culture can meet the pro- duction requirements of fowl pox vaccine.

黄芩苷体外抗IBV QX株的作用研究

为研究黄芩苷体外抗禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)QX株的效果,试验对IBV进行复壮与扩繁,制备原代鸡胚肾(CEK)细胞,并测定IBV对CEK细胞的TCID50和黄芩苷对CEK细胞的最大无毒浓度(MNTC);在MNTC基础上采用CCK法测定不同浓度黄芩苷对IBV的有效抑制率,观察不同浓度黄芩苷对IBV导致的CEK细胞的细胞病变效应(CPE)的抑制情况,并采用qPCR法测定不同浓度黄芩苷对IBV N基因相对表达量的影响。结果表明:成功复壮并扩繁了IBV,其未被其他病毒污染,对CEK细胞的TCID50为1×10^(-4.75)/0.1 mL;黄芩苷对CEK细胞的MNTC为9.75 mg/L;该浓度黄芩苷对IBV的有效抑制率最高,为64.03%,能有效减轻IBV对CEK细胞的CPE;各浓度黄芩苷均可以极显著降低CEK细胞中IBV N基因相对表达量(P<0.01)。说明黄芩苷对CEK细胞的MNTC为9.75 mg/L,该浓度黄芩苷具有较好的体外抗IBV QX株的作用。

空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究

[目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。[结果]在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0.05);与病毒对照组相比,AETAC浓度为5~30μg/mL时,4种抗AIV-H9N2作用方式下,药物组细胞存活率均显著升高(P<0.05)。4种作用方式下,DF-1细胞存活率分别为8.15%~64.96%(预防感染)、8.56%~83.83%(影响复制)、1.82%~5.90%(阻止吸附)和6.90%~40.12%(直接杀灭)。AETAC对鸡胚的最大安全浓度为16.41 mg/mL,对感染鸡胚的最佳给药方式为AETAC和病毒混合后接种。以最佳体内作用方式给药后,AETAC中、低浓度组鸡胚存活率为40%~60%,高浓度组鸡胚全部存活,胚胎喙部发育明显,鸡胚法氏囊淋巴滤泡发育完整,滤泡大小和数量正常,充血量少,组织病理状态改善。[结论]AETAC在体内外对AIV-H9N2均具有显著的抑制作用,且主要与影响病毒复制作用方式相关。

鸡蛋开窗法导入供体胚盘细胞对家鸡胚胎发育的影响研究

通过 4批孵化实验 ,研究鸡蛋开窗法注射供体胚盘细胞对受体鸡胚发育及孵化率的影响 .GLM方差分析表明 ,开窗处理极显著降低整个孵化期 (2 1 d)的活胚比例 (P<0 .0 1 ) ,至 2 1日龄出壳时 ,处理组的孵化率为 0 .8%～ 6.0 % .导入供体胚盘细胞对受体鸡胚的发育仅为阶段性影响 ,表现在显著降低孵化第 8日龄左右的活胚比例 (P<0 .0 5 ) ,而对后期发育的影响不显著 (P>0 .0 5 ) .因此 ,鸡蛋开窗处理是降低受体胚胎成活率和孵化率的主要原因 。

麝香保心丸对鸡胚绒毛尿囊膜及培养的血管内皮细胞的促血管生成作用

目的 :探讨麝香保心丸在鸡胚绒毛尿囊膜模型及培养的微血管内皮细胞系统中的促血管生成作用。方法 :分别以重组碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF ,贝复济 )和生理盐水为阳性和阴性对照 ,作用于绒毛尿囊膜 (chrioallantoicmembrane ,CAM) ,通过一级、二级血管计数 ,初步评价麝香保心丸的促血管生成活性 ;并通过观察它对培养的牛肾上腺微血管内皮细胞增殖及管腔结构形成的影响 ,验证其促血管生成效应 ;同时检测麝香保心丸作用于培养的人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子 (VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的mRNA表达及其上清液中VEGF、bFGF含量 ,初步探索其作用机理。结果 :麝香保心丸组CAM上血管数比生理盐水组明显增加 ;麝香保心丸组内皮细胞及管腔数目均较生理盐水组明显增多 ,前者细胞表达VEGF和bFGFmRNA明显增高 ,上清液中VEGF和bFGF含量明显增多。结论 :麝香保心丸能促进CAM及培养的微血管内皮细胞的血管生成。

鸡胚及禽类细胞系在生物医药领域的应用及研究进展

鸡胚因发育过程清楚,长久以来作为基础和应用科学研究领域重要的实验模型,尤其在鸡胚发育早期绒毛尿囊膜阶段,因其血管丰富,是天然的免疫缺陷宿主,是病理学、药理学和肿瘤学等研究领域的理想实验模型。作者简述了发育早期的鸡胚组织结构,并介绍了鸡胚绒毛尿囊膜在肿瘤研究、血管生成、器官移植、烧伤等疾病机理研究中的应用,以及在鸡胚病理模型基础上进行的抗肿瘤药物筛选的应用。重点介绍了鸡胚及禽类细胞系在病毒繁殖和疫苗生产、治疗性蛋白和单抗生产方面的应用研究进展。多种人源病毒、禽源病毒、支原体等可在鸡胚及禽类细胞上增殖,并用于疫苗生产。作者对常用的禽类纤维原细胞和多能干细胞的发展和特点进行了阐述,并总结了商业化的禽类细胞系来源以及部分易感病毒。鸡胚表达系统能够在目的蛋白特定位点产生人源化糖基,减少目的蛋白对人的过敏反应,且禽蛋廉价易得,可作为生产人用单克隆抗体和治疗性蛋白的合适供体。作者介绍了鸡胚及禽类细胞系在生物医药领域应用的最新进展,并对鸡胚作为动物模型在未来的应用进行了展望。

鸡传染性支气管炎病毒在鸡胚肾细胞和气管环培养中的适应性比较

将６株鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分别接种鸡胚肾细胞（ＣＥＫＣ）和气管环培养（ＴＯＣ）。６株病毒无论是否已经适应于鸡胚，都在气管环培养中能引起病变。病毒适应于ＣＥＫＣ，是与病毒在鸡胚和细胞培养上的传代次数有关。分别用ＳＰＦ鸡胚、非免疫鸡胚和普通鸡胚制备的ＴＯＣ测定ＩＢＶ－Ｍ４１株的ＩＤ５０，结果用ＳＰＦ鸡胚和非免疫鸡胚制备的ＴＯＣ测定的ＩＤ５０都获得较高滴度，而在普通鸡胚制备的ＴＯＣ中ＩＤ５０明显低。

卵泡刺激素和雌激素对培养的鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响

在动物体内多种激素共同调控着卵巢生殖细胞的生长、发育和成熟 ,其中促性腺激素起着至关重要的作用。本实验建立了鸡胚 ( 1 8日胚龄 )卵巢构建生殖细胞和体细胞的共培养模型 ,并研究卵泡刺激素(FSH)、 1 7β雌二醇 (E2 )以及二者联合处理对生殖细胞增殖的影响。结果发现FSH ( 0 2 5～ 1 0IU/mL)、E2( 1 0～ 1 0 0 0ng/mL)处理 4 8h后均可显著促进生殖细胞的增殖 ,FSH与E2 共同处理作用更加显著且高于其单独处理组 ,表明FSH和E2 可协同刺激鸡胚卵巢生殖细胞的增殖 ,FSH可能是通过促进雌激素或其受体的合成而发挥作用。

鲨鱼软骨制剂抑制血管生成的研究

以鲨鱼软骨为原料 ,经盐酸胍抽提 ,丙酮分级沉淀 ,超滤等步骤得到鲨鱼软骨制剂 (sharkcartilagepreparation ,SCP) .利用整装细胞扫描电镜方法测定SCP对血管内皮细胞骨架系统的影响 ,体外细胞迁移实验测定它对内皮细胞迁移的抑制效应 ,及鸡胚绒毛尿囊膜实验测定对血管生成的抑制效应 .结果表明SCP能显著抑制内皮细胞的骨架形成 ;显著抑制内皮细胞的迁移 ,并有明显的浓度依赖关系 ;显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成 .细胞骨架是细胞分裂增殖及运动迁移的基础 ,血管内皮细胞的运动迁移又是血管生成的基础 ,因此SCP的作用机理可能是通过抑制细胞骨架的形成 ,抑制内皮细胞的运动迁移 。

一种肌腱缝合线的细胞毒性研究

为检测采用海狸鼠尾部肌腱经过脱脂、脱水、两次固定等一系列加工过程而制成的新型可吸收手术缝合线的细胞毒性,将它与鸡胚成纤维细胞共同体外培养,观察其对细胞形态和增殖率的影响.结果表明,这种缝合线对细胞形态无影响,对细胞增殖有一定的促进作用,细胞相容性好,符合医用缝合线的要求.

腺病毒载体介导的GFP在鸡胚成纤维细胞中的表达及RNA干涉

鸡胚成纤维细胞(CEF)是多种动物及人类病毒的易感细胞;也是研究鸡的基因组功能的理想材料.本试验的目的是研究非复制型腺病毒载体对CEF的转染效率及安全性;并建立在CEF细胞中进行RNAi的技术平台.采用GFP重组非复制型腺病毒载体(Ade-GFP)转染CEF细胞;结果证明0.1-2000 MOI Adv-GFP均可转染CEF细胞并表达GFP;转染后16h开始出现GFP阳性细胞;胞核与胞浆可见明亮的荧光;荧光细胞数量及荧光强度在24～36h达到高峰;以后逐渐衰减;约180h全部消失;转染效率最高为22.3%;形态学观察及流式细胞仪测定结果显示;Adv-GFP转染的CEF细胞未见细胞病变;多数转染组细胞活力不受影响;说明用Adv-GFP携带外源转染CEF细胞是安全可行的;用脂质体转染试剂转染化学合成的GFP-siRNA;成功地干涉了腺病毒载体介导的GFP基因在鸡胚成纤维细胞的表达;干涉效率为85%;证明了鸡胚成纤维细胞中存在RNAi机制;为进一步利用非复制型腺病毒载体递送siRNA在CEF细胞内进行RNAi的研究奠定了基础.

鸡小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

选择组织块法分离培养鸡小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC),采用机械刮除法和相差消化-相差贴壁法纯化细胞,0.05%的Trypsin-EDTA对获得的IEC进行消化传代,免疫细胞化学法鉴定IEC。结果表明,组织块培养法可分离出活性较强的IEC,并获得纯化的上皮细胞;形态学和免疫细胞化学法检测显示获得的细胞表面抗原呈阳性,鉴定为IEC;纯化的IEC可在体外稳定传代。

鸡胚细胞内微量元素分析

本文用高分辨率、高灵敏度的扫描质子微探针 (SPM )对鸡胚前脑神经元细胞和骨骼肌肌管细胞中的微量元素进行分析 ,研究了这两种不同细胞对Zn离子的吸收情况、细胞中元素的相关关系以及微量元素在细胞内的分布情况。结果发现 ,鸡胚前脑神经元细胞对Zn离子的吸收能力明显大于骨骼肌肌管细胞 ;并且细胞中Cr、Fe、Ni等微量元素的浓度含量明显偏高 ;细胞中S -Zn、Fe -Zn等元素呈正相关关系 ,而P -Ni、Cr-Fe则呈负相关关系。从细胞的元素分布图上还发现不同元素在细胞各个组成部分的含量是不同的 ,如P、S。

三种多糖对鸡胚肝细胞抗氧化能力的影响

为了研制抗氧化中药多糖制剂,比较了枸杞多糖(LBP)、白术多糖(AMP)和当归多糖(CAP)对鸡胚肝细胞(CEL)的抗氧化能力的影响,以维生素C(VC)为对照。首先测定了4个药对CEL的安全浓度,然后取安全浓度范围内3种浓度的各药分别加入到CEL的培养体系中,培养24h后加入H_2O_2攻击1h,测定细胞活力(A_(570nm))、细胞内ROS含量、GSH-Px和SOD的活性。结果显示,H_2O_2组的A_(570nm)值最小、ROS含量最高、GSH-Px和SOD活性最低,均与细胞对照组的差异显著(P<0.05);3个多糖组和VC组的A_(570nm)值均大于或显著大于、ROS含量均低于或显著低于、GSH-Px和SOD活性均高于或显著高于H_2O_2组,高浓度的作用最显著(P<0.05);LBP组3个浓度的作用均强于同浓度的AMP组和CAP组,相当于甚至优于VC。结果表明,3种多糖均具有较强的抗氧化活性,能够抵抗H_2O_2攻击引起的鸡胚肝细胞活力降低、细胞内ROS含量升高和抗氧化酶活性降低,从而增强鸡胚肝细胞的抗氧化能力,LBP的作用最强,可以考虑作为多糖类抗氧化剂。

雄激素对培养的鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响

利用鸡胚性腺生殖细胞-体细胞体外无血清共培养模型研究雄激素对生殖细胞增殖的影响。培养的鸡胚卵巢细胞用睾酮(T,10-8、10-7、10-6mol/L)和/或芳香化酶抑制剂letrozole(Let,10-9、10-8、10-7mol/L)处理,48h后测定生殖细胞增殖的变化。结果显示,睾酮能够促进卵巢生殖细胞的增殖,且这种促增殖作用可被Let部分阻断。由此推断,睾酮的这种促进鸡胚卵巢生殖细胞增殖的作用,部分是通过转变为雌激素才得以发挥的。

鸡胚小肠上皮细胞的分离培养及其热应激效应

【目的】比较不同消化酶对鸡胚小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)的分离和培养效果及细胞的热应激能力,为后续研究提供依据。【方法】以15日龄鸡胚为研究对象,分别使用0.5 g/L胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合及中性蛋白酶Ⅱ消化分离其小肠上皮细胞。培养不同时间后,观察IECs的生长状态,测定细胞生长活性;通过免疫荧光染色和免疫组化对所得IECs进行鉴定,确定最佳的消化酶。对优化所得鸡胚IECs于42℃分别进行2,3,4 h热应激处理,以37℃处理的IECs为对照,MTT法和流式细胞测定IECs的相对活力和凋亡率。【结果】细胞形态学观察发现,用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离得到了大量小肠绒毛隐窝团块,易贴壁,细胞生长快;用0.5 g/L胰蛋白酶和中性蛋白酶Ⅱ消化分离得到的细胞数量少,贴壁慢。用3种酶消化方法分离的细胞生长曲线均呈“S”形,但用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离的细胞生长曲线峰值较高,细胞活性强;联合消化所得IECs特异性标记抗原均为阳性,免疫荧光阳性率达(92.7±7.9)%,细胞膜质呈棕黄色,而对照组细胞膜质无着色。42℃下热应激3 h后细胞活力极显著下降,凋亡率为(35.96±1.57)%,极显著高于对照组的(0.67±0.02)%,可进行后续试验。【结论】采用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化可得到IECs;42℃下处理3 h是构建IECs热应激模型的条件。

鸡胚盲肠上皮细胞的传代培养

本研究旨在探讨鸡胚盲肠上皮细胞传代培养条件及其特性,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型。分别用胰酶-EDTA联合消化和分步消化2种方法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定贴壁细胞覆盖率选择细胞传代的适宜消化方式;筛选了传代细胞培养液中L-GLN和胰岛素的最佳浓度,通过贴壁差进一步纯化盲肠上皮细胞,探索其合适的培养条件。通过形态学观察、透射电镜、免疫组织化学技术、组织化学技术、糖原染色、流式细胞术的方法对传代细胞特性进行了鉴定。结果表明:胰酶-EDTA联合消化、15min贴壁差纯化除去成纤维细胞,72.5mg.L-1 L-GLN、0.05mg.L-1胰岛素和5%FBS的传代细胞培养液更有利于盲肠上皮细胞的生长;经形态学和透射电镜观察,AKP、Vimentin及PAS染色,所培养的传代细胞具有典型的上皮细胞特征,在传代后24～72h盲肠上皮细胞纯度达95%以上,贴壁细胞覆盖率达85%以上;细胞凋亡测定表明,细胞连传5代,活性较好,第6代细胞凋亡率显著增加,贴壁细胞覆盖率降低。本研究提示用该法传代可获得稳定、数量大、活性高、纯度高的鸡胚盲肠上皮细胞。

空肠弯曲杆菌感染对鸡胚肠上皮细胞TLR1和TLR15 mRNA转录水平的影响

研究以鸡胚肠上皮细胞为模型,采用相对荧光定量PCR技术检测空肠弯曲杆菌感染对鸡胚肠上皮细胞Toll样受体(TLR)1和15 mRNA转录水平的影响,探讨TLR1和TLR15在抵抗空肠弯曲杆菌感染中的作用及其机制。结果显示:正常的鸡胚肠上皮细胞能检测到TLR1和TLR15 mRNA的转录;空肠弯曲杆菌感染细胞后,TLR1在3 h后转录水平提高,12 h达到高峰;TLR15在感染后6 h转录水平达到高峰,至12 h略有下降;在整个试验周期感染组TLR1和TLR15 mRNA转录水平都极显著高于对照组(P<0.01)。以上研究表明TLR1和TLR15与肠上皮细胞抗空肠弯曲杆菌感染免疫反应具有相关性,TLR在细胞中的表达使得该细胞有能力抵御外界多种病原微生物的入侵。

传染性法氏囊病病毒在鸡胚细胞上的优化繁殖

研究了传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）在鸡胚细胞上繁殖的优化条件，结果表明，鸡胚细胞体外增殖培养后对ＩＢＤＶ的敏感性并不减弱，而且有提高。维持培养基中血清浓度的变化（体积分数在０．０１～０．１０范围内）对病毒的繁殖影响不大。该病毒更适宜于稍偏酸性和较高温度下繁殖。

鸡传染性支气管炎(IB)H_(120)细胞弱毒疫苗研究

通过近三年试验,研制出鸡传染性支气管炎毒株IB H_(120)细胞弱毒苗,经室内外近40万羽雏鸡免疫试验表明:该苗以每羽0.01ml滴鼻、点眼或口服免疫4～12日龄雏鸡,7d后产生免疫力;免疫后17d、32d、60d抗标准强毒攻击的免疫保护率分别为88.7%、87.5%、87.5%,免疫期可达二个月;其最小免疫量为0.001ml/羽;以10个免疫剂量接种雏鸡无任何不良反应,安全性能良好;-20℃保存半年、4℃保存一个月效力不变.