建立数字PCR检测非小细胞肺癌溶酶体相关的4次跨膜蛋白B基因拷贝数变异方法

建立芯片式数字PCR(dPCR)检测非小细胞肺癌(NSCLC)LAPTM4B基因拷贝数变异方法,并初步评估其基本性能和临床应用的可行性。设计LAPTM4B基因引物及特异性探针,建立dPCR反应体系,根据制备的不同浓度目的DNA样品验证该检测方法的最低检测限、精密度和线性范围。本研究首次建立并优化dPCR检测LAPTM4B基因拷贝数的反应体系,分析数据显示,该方法最低检测到12.5%的LAPTM4B基因拷贝数缺失,批间精密度变异系数CV<10%,且缺失比例在12.5%~100%范围内线性良好(R^(2)>0.99)。此外,收集2021年3月至7月于北京大学肿瘤医院就诊的6例NSCLC患者,采用自建方法检测其冰冻组织标本,探究其临床应用可行性。dPCR结果显示,其中5例患者的组织样本存在LAPTM4B基因拷贝数缺失,1例出现拷贝数增加,推测可能与其术前化疗有关。综上所述,本研究成功应用芯片式dPCR方法,建立非小细胞肺癌LAPTM4B基因拷贝数变异的检测体系,并在组织标本中初步证实其临床应用的价值。

芯片式数字PCR检测禽流感病毒方法的性能验证

目的 对芯片式数字PCR检测禽流感病毒的方法进行评估,并与荧光定量PCR方法进行比较。方法 分别用芯片式数字PCR(dPCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)两种方法检测不同浓度梯度的质粒标准品,对两种方法检测结果的线性范围,一致性,批内精密度,最低检出限等方面进行比较评估。并对31份农贸市场禽流感环境标本分别用数字PCR和实时荧光定量PCR检测,利用配对卡方检验来评估两种方法阳性率的差异,并用Bland-Altman法分析与荧光定量PCR方法的一致性。结果 质粒标准品在3.05×10~2copies/mL~1.00×10~7copies/mL的浓度范围内,与dPCR检测值呈良好的线性关系,R~2=0.9969,dPCR和qPCR在线性范围内斜率之间的差异无统计学意义(F=0.996,P=0.321);dPCR在不同稀释度的批内精密度变异系数(CV)范围为2.36%~22.78%;dPCR的估计检测下限(LOD)为410(95%CI:344~570)copies/mL,qPCR的估计LOD为845(95%CI:749~1 004)copies/mL;用dPCR和qPCR检测31份农贸市场环境标本,dPCR的检出率96.8%,qPCR的检出率80.6%(Kappa=0.244,P=0.063)。结论 本研究验证了芯片式数字PCR系统的性能及其与荧光定量PCR系统的方法学比较。芯片式数字PCR在其动态范围内表现出良好的线性,R~2=0.996 9,能够准确且高精度(CV)范围为2.36%~22.78%的定量不同浓度(3.05×10~2~1.00×10~7copies/mL)的复杂样本。

转基因大豆MON89788双重数字PCR通用定量检测方法的建立

建立一种特异、稳定、灵敏、通用的转基因大豆MON89788品系双重数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,d PCR)定量检测方法,在一个体系内同时进行内外源基因的定量检测,适用于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)和芯片式数字PCR(chip digital PCR,cd PCR)平台,并通过了食品分析能力评价体系国际能力验证项目的盲样检测评价。dd PCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为8.0 copies/μL和8.2 copies/μL;cd PCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为7.443 copies/μL和7.646 copies/μL;dd PCR和cd PCR对转基因大豆MON89788品系成分相对含量的相对定量限均为0.1%。

数字PCR技术的发展和应用

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术作为一种全新的核酸检测方法,通过把反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量。目前dPCR主要分为微滴式和芯片式两种。与传统PCR技术相比,dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点。因此,dPCR技术在近年来得到了迅速的发展,广泛地应用于稀有突变检测、拷贝数变异分析和复杂样本基因表达检测等方面。

一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片

构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应(数字PCR)微流控芯片.应用多层软光刻技术,以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料,盖玻片作为基底制作了具有3层结构以及微阀控制功能的微流控芯片.芯片的大小与载玻片相当,可同时检测4个样品,每个样品通入芯片后平均分配到640个反应小室,每个小室的体积为6 nL.以从肺癌细胞A549中提取的18sRNA为样品检测了该芯片的可行性.将样品稀释数倍后通入芯片,核酸分子随机分布在640个小室中并扩增.核酸分子在芯片中的分布符合泊松分布原理,当样品中待测核酸分子平均拷贝数低于0.5个/小室时,则每个反应小室包含0个或1个分子.经过PCR扩增后,有模板分子的小室检测结果为阳性反应,而无模板分子的小室为阴性反应,最后通过计数阳性反应室的个数,可绝对定量原始待测样品中的目标DNA分子拷贝数.实验结果表明,该数字PCR芯片可实现DNA单分子反应和核酸绝对定量,具有成本低、灵敏度高、节省时间和试剂以及操作简单等优点,为数字PCR方法在普通实验室的应用提供了一种新途径,可用于癌症及感染性疾病的早期诊断、单细胞分析、产前诊断以及各种细菌病毒的核酸检验等研究.

一种大有前途的分析和诊断新技术:大规模集成流路(IFC)芯片-数字PCR

本文评述了新近发展起来的以大规模集成流路(IFC)芯片为基础的数字PCR技术。指出PCR已被证明可用于除外伤和营养不良症以外所有其他疾病的分子诊断。但是传统PCR技术有误诊率高的缺点,即便采用传统的数字PCR技术,也还会有2%以上的差错率。但是当采用IFC芯片作数字PCR检测时,将可使测量准确度达到99.75%以上,并可做绝对测量,因而在各种疾病早期分子诊断方面具有其他方法无法比拟的巨大潜力。

生物芯片中PCR温控系统的研究

聚合酶链反应在温度控制系统(PCR温控系统)中对反应时间和集成化设计提出了严格的要求,因此聚合酶链反应的温度控制系统必须进行实时监控,而且易于集成到一体化芯片上.本文设计了PCR的温度控制系统,并编写了上位机监视软件,为加热器的选型提供了直观的参考.

火鸡源性成分数字PCR通用定量检测方法的研究

建立了一种特异、灵敏和通用的火鸡源性成分数字PCR(digital Polymerase Chain Reaction,dPCR)定量检测方法,可对肉制品中火鸡源性成分的质量百分比进行准确定量,同时适用于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)和芯片式数字PCR(chip digital PCR,cdPCR)平台。ddPCR平台对火鸡源性成分拷贝数浓度定性检测限(Limit of Detection,LOD)和定量检测限(Limit of Quantitation,LOQ)分别为1.75和6.43 copies·μL^(-1),cdPCR平台对火鸡源性成分拷贝数浓度LOD和LOQ分别为1.71和3.43 copies·μL^(-1)。对混合鲜肉中火鸡源性成分的质量百分比定量检测限为5%。本方法可对食品中火鸡源性成分进行定量检测。

数字PCR在食源性致病微生物检测中的应用研究进展

大多数食源性疾病由食源性致病微生物引发,研究和建立食源性致病微生物的快速有效检测方法对于食品安全风险监控及保障人们的身体健康具有重要意义。相对于传统PCR,数字PCR具有较好的准确度和重现性,可实现绝对定量分析,为快速准确地进行食品安全检测提供了一种崭新的技术平台。本文主要介绍了数字PCR中微滴式数字PCR和芯片式数字PCR的基本原理、种类、应用及其研究进展,深入探讨了数字PCR技术在沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、阴沟杆菌和金黄色葡萄球菌等食源性致病微生物检测中的应用。数字PCR技术目前在转基因成分和动物源性成分定量检测中都得到了较好的应用,在食源性致病微生物中的应用技术还有待更好的发展。

微孔式数字PCR荧光芯片的自动对焦

为了快速获取微孔式数字PCR芯片清晰的荧光图像,解决传统方法针对微尺度阵列单元自动对焦存在的计算量大,耗时长等问题,建立了基于像素个数随离焦距离变化特征模型的自动对焦方法。依次取3个彼此间隔相同距离的微孔式数字PCR芯片的荧光图像,通过自适应窗口选取与阈值计算,统计窗口区域内大于阈值的像素个数,代入特征函数计算离焦距离,并通过统计出的3个位置的像素个数值判断离焦方向,继而进行对焦。该方法仅需统计13×13个像素大小的对焦窗口中灰度大于阈值的像素个数,且完成对焦仅需4步,对焦结果完全满足后续计算的清晰度要求,与传统爬山方法相比,对焦步骤数平均减少了51.89%,实现了微孔式数字PCR芯片的准确快速对焦。本文提出的自动对焦方法克服了现有算法计算量大、对焦步骤繁琐的缺点,预测准确、速度快,最大程度上减少样本曝光时间,进而减少荧光的淬灭,为后续计算提供更为原始且精确的图像。

用于高集成度数字PCR平台的微流控芯片

数字聚合酶链式反应(PCR)是一种强大且应用广泛的核酸检测技术。现有数字PCR平台大多存在体积庞大、集成度低、耗材价格高、样品消耗大和人工干预多等缺点。设计并制备了一款基于样本自分离的低成本数字PCR微流控芯片,该芯片的独立PCR微反应腔室数量达到37440个。通过对芯片进行进样效率、亲水性改良以及透光性研究,验证了该芯片完全可以满足高集成度数字PCR平台的实验需求。实验结果表明,芯片样液注入与防蒸发矿物油注入全过程可以在2 min内完成,且样品消耗总体积在2μL以内。根据进样腔室数量占总腔室数量比例,得出芯片进样效率可以达到99%以上,且经过亲水性处理后的芯片透光率可达到90%以上。该微流控芯片能很好地满足高集成度数字PCR平台的使用需求。

聚二甲基硅氧烷球形微腔阵列的数字PCR芯片

数字聚合酶链式反应(d PCR)技术是一种核酸绝对定量技术,但现有d PCR平台因其昂贵的设备或复杂的操作限制了其实际应用。利用气体膨胀浇注成型技术,结合集成微腔阵列的模具,设计、制作了一种成本低廉、简单可靠的d PCR微流控芯片。独特的球形微腔为液滴存储提供了更稳定的几何形式,保证了样品数字离散化的可靠性和稳定性。同时,芯片还利用预脱气的聚二甲基硅氧烷(PDMS)实现自动进样和样品离散化,大大降低了对复杂昂贵设备的依赖,且提供了更高集成度。利用芯片进行了EGFR基因第19号外显子数字PCR定量检测,验证了该芯片的实用性。

一种用于核酸绝对定量检测的高鲁棒性液滴式数字PCR芯片

为满足液滴式数字聚合酶链式反应(PCR)技术对扩增反应过程中稳定保存液滴以及反应后高效检测的核心需求,构建了一种具有过滤气泡和增强荧光信号功能的液滴式数字聚合酶链式反应芯片.该芯片可在10 min内产生20多万个半径约为21μm的液滴.利用"玻璃天花板"的方式构建了独立于芯片主体材料的液滴收集腔,为液滴提供稳定的保存与反应环境;还构建了过滤结构,可有效过滤混入液相中的空气,提高芯片鲁棒性.同时,在液滴收集腔中引入反射层,增强荧光信号,使单个视野荧光成像时间缩短约40%,提高了检测效率.利用该芯片定量检测EGFR基因第21号外显子,检测信号与DNA浓度在10~1~10~5copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R^2=0.998).该方案在载玻片大小的芯片上实现了液滴产生、PCR扩增和荧光信号读取,并具有较高的鲁棒性与检测效率,在核酸检测等方面具有应用潜力.

数字电视时钟恢复和减小PCR抖动影响的方法

讨论了MPEG-2标准中PCR字段在数字电视接收系统中的作用和本地时钟的恢复方法,提出了一种基于数字电视芯片PLM3K平台的系统时钟恢复和减小PCR抖动影响的软件解决方案,具有较高的工程应用价值。

一种用于数字PCR的微流控芯片的设计、制作和性能验证

为了获得可大批量制作并用于数字PCR技术的低成本的微流控芯片,采用注塑工艺制作了一种新型的微滴式数字PCR芯片。芯片材料为具有良好光学性能的环烯烃共聚物(COC),通道结构采用十字交叉型设计。将数字PCR试剂通过COC芯片可以产生直径为40μm的微滴(体积为16.75μL),通过在光学检测平台对比COC芯片和PDMS芯片生成的微滴的脉宽CV值和荧光CV值,证明了COC芯片具有良好的液滴生成效果;通过对人体EGFR基因质粒的绝对定量能力实验结果,表明芯片在101~106copies/μL范围内与DNA理论浓度具有很好的相关性。

肉制品中牛源性成分芯片数字PCR定量检测方法的建立

目的为了对肉制品中牛肉源性成分进行准确定量,本文采用数字PCR(dPCR)技术对牛肉的线粒体Cytb基因进行定量检测,根据基因拷贝数建立了肉制品中牛肉源性成分PCR的定量检测方法。方法参照标准设计的牛源性特异性引物、探针,猪源性特异性引物、探针,鸭源性特异性引物、探针以及动物源性成分通用引物、探针,建立了双重数字PCR体系。结果在一定范围内生鲜牛肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,并以DNA含量为中间值计算出DNA拷贝数(C)与生鲜牛肉质量之间的换算公式:M_(牛)=0.0209C+0.676。应用建立的dPCR方法对构建的肉样模型进行检测,结果显示牛肉定量检测值与实际质量基本一致,且受外源物种的干扰小。运用该方法对抽取的10份市售牛肉样品检测,同时通过特异/通用引物扩增的拷贝数之比(%)辅助判断肉制品中是否存在非牛源性的其他动物源性成分掺假,检测出部分样品不符合标签规定。结论该方法可实现对牛源性成分的量化检测,能够作为区分故意添加和无意污染的依据,为执法监管部门提供有力的技术保障。

液滴数字聚合酶链式反应芯片及其在致病菌检测中的应用

设计与制作了一种基于聚二甲基硅氧烷-玻璃(PDMS-Glass)的多功能集成式液滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)芯片,该芯片由产生液滴的PDMS模块和收集液滴的玻璃腔体模块组成。PDMS模块采用双通道的T形结构设计,液滴产生速度快且通量高,在30 min内可生成2×10~6个直径约为20μm的微液滴。玻璃腔体模块中存储的液滴在整个实验过程中无需转移,可直接在原位PCR仪上进行扩增,每个液滴均是一个微反应器,经过多次热循环后,液滴仍能保持良好的稳定性。选用副溶血性弧菌(VP)作为食源性致病菌的研究模型,考察了ddPCR芯片对其基因组DNA的绝对定量能力,结果表明,该ddPCR芯片对VP基因组DNA绝对定量的线性范围宽,可跨越5个数量级(10~1~10~6 copies/μL),定量结果与DNA理论参考浓度间有很好的相关性。

分子诊断技术在乳腺癌检测中的最新进展

乳腺癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤,对其致病基因的检测有助于肿瘤早期诊断、精准治疗及预后评估.本文总结了近年来乳腺癌相关的热点基因,并对相关基因的分子诊断技术、检测方法及应用进行了综述.首次评述了数字PCR方法用于乳腺癌分子检测的进展.全面对比不同分子诊断技术的差别与优缺点,为乳腺癌关键基因的检测提供指导建议与理论支持,并对未来发展趋势做出展望.

一种用于核酸高灵敏检测的液滴式数字聚合酶链式反应芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,构建了一种新型的液滴式数字聚合酶链式反应(dd PCR)芯片.该芯片由产生液滴的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块和储存液滴的玻璃腔室构成.实验结果表明,该芯片可以在25 min内产生2×106个直径为20μm的微液滴(体积4.187 p L).利用该芯片定量检测了表皮生长因子受体(EGFR)基因第19号外显子,在DNA浓度为106~101copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9998);在浓度为106copies/μL的19号外显子野生型DNA中检测105~100copies/μL的突变型DNA,其检测敏感度可达到0.0001%.该方法在同一芯片上实现了液滴产生、核酸扩增和荧光信号读取的功能,在核酸绝对定量及痕量突变基因的检测中具有潜在应用前景.

rAAV5基因组滴度测定的数字PCR方法研究

目的:建立并验证重组5型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 5,rAAV5)基因组滴度测定的数字PCR方法,并对微滴数字PCR方法和芯片数字PCR方法进行比较。方法:分别用不同浓度的SDS和EDTA前处理r AAV5样品,用微滴数字PCR测其基因组滴度,对病毒样品前处理试剂进行优化;在其他试验条件不变的情况下,分别设置微滴数字PCR的退火温度为60、58、54、52℃,以WPRE引物扩增,比较扩增效果,对数字PCR的退火温度进行优化;分别采用微滴数字PCR和芯片数字PCR测定rAAV5的基因组滴度并比较。结果:终浓度为1%SDS和62.5 mmol·L^(-1)EDTA按1∶1(v/v)的比例混合后前处理rAAV5,测定的基因组拷贝数较高,前处理液裂解效果较好;当退火温度为54℃时,微滴数字PCR中阳性微滴和阴性微滴分离效果最好,扩增特异性最强;2种测定结果的试验室内精密度和回收率接近,测定同一裂解样本的结果较为接近(在1个数量级)。结论:初步建立了数字PCR方法并验证,为后续的进一步验证奠定基础。