免疫亲和层析技术协同酶联免疫吸附法检测赭曲霉毒素A

利用免疫亲和层析技术(immunoaffinity chromatography,IAC)对样品中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)进行捕获与浓缩,利用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法对IAC捕获的目标物OTA进行测定。IAC与ELISA中的抗OTA单克隆抗体来自不同的克隆株,分属不同独特型,与OTA结合靶点的选择性存在差异,IAC与ELISA协同检测,可以有效过滤OTA结构类似物造成的干扰,提高免疫分析的特异性与灵敏度。该方法用于加标样品测定时,OTA的检出限为0.2 ng/g,定量限为0.4 ng/g,OTA的平均回收率为75.9%,与单一的ELISA法相比,该方法虽然回收率略低,但灵敏度可以显著提高,达到ELISA法的60倍。通过对49份样品的实际检测,该方法检出阳性样品与国标法的符合率达到100%,漏检率为0%,由此可见,该方法在准确性上表现出明显的优势。作为一种综合免疫分析技术,该方法不需要大型仪器设备,对操作环境没有严格要求,便于基层实验室对样品中OTA的分析。

Oligo(dT)亲和层析介质的载量比较和机制分析

针对Oligo(d T)亲和层析介质的吸附性能,以poly(A)为模型分子,考察了4种Oligo(d T)亲和层析介质的静态吸附平衡、吸附动力学和动态结合载量(DBC),探讨了载量影响相关机制。结果表明,4种介质的合适吸附条件均为0.6 mol·L-1Na Cl、p H=6~7;Monomix d T20静态吸附容量最大,且poly(A)能扩散至介质微球深层孔内,而Poros Oligo(d T)25、Praesto Jetted (d T)25和Nano Gel d T20等3种介质中poly(A)均主要为表层吸附、静态吸附容量稍低;对于DBC,Nano Gel d T20和Monomix d T20的10%穿透的DBC较高,而Poros Oligo (d T)25和Praesto Jetted (d T)25相对略低。经分析,影响载量的主要因素包含基质种类、微球孔径、配基密度、间隔臂和配基长度等。对于基质种类,聚苯乙烯基质可能孔道结构较为特别。对于微球孔径,应针对不同大小的m RNA分子定制不同孔径的微球,以平衡传质阻力与可及吸附表面积之间的矛盾,从而增大DBC。

莱克多巴胺单克隆抗体非亲和层析法纯化研究

抗体纯化对免疫测定和生物偶联的灵敏度、重现性和稳定性具有重要影响。本文对硫酸铵沉淀法(Ammonium sulfate precipitation,AS)及AS分别与阴离子交换层析法(Anion exchange chromatography,AEC)、阳离子交换层析法(Cation exchange chromatography,CEC)、疏水作用层析法(Hydrophobic interaction chromatography,HIC)和陶瓷羟基磷灰石法(Ceramic hydroxyapatite,CHT)联合应用纯化腹水来源的莱克多巴胺单克隆抗体(Ractopamine monoclonal antibody,RAC-mAb)进行了研究。优化缓冲液pH、盐浓度及层析介质,分别采用Bradford法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、间接竞争酶联免疫吸附试验(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)和胶体金免疫层析技术(Colloidal gold immunochromatography,CGIC)对抗体纯化后回收率、纯度及生物学活性进行评估。结果显示,采用AS+AEC法纯化抗体回收率高、纯度和生物学活性好,抗体回收率为40.1%,纯度为75.1%,经icELISA平行测定3次所得灵敏度(IC_(50))最佳为1.73±0.22 ng/mL,CGIC测定其在PBS及猪尿样本添加cut-off值分别为5 ng/mL和60 ng/mL。本研究为单克隆抗体纯化提供了理论参考和必要的实验基础。

应用亲和层析制备萝卜叶溶菌酶

应用脱氨几丁质亲和层析直接从萝卜叶粗提液中制备溶菌酶，所得精酶比活力为４２１６２Ｕ／ｍｇ蛋白，活力回收为６５％，得率为１Ｏ．６μｇ／ｇ鲜叶，纯化倍数为７７．４倍。效果优于应用几丁质、ＣＭ－几丁质的纯化效果。

免疫亲和层析技术及其医药应用进展

综述了免疫亲和层析技术的发展现状,包括层析介质、层析剂制备方法、洗脱方法等的最新进展,以及免疫亲和层析技术在制药领域和临床方面的应用,包括抗体和抗原的纯化、临床检测、免疫分析等。

亲和层析微柱法测定肝癌特异性AFP

目的建立一种方便、经济的方法检测血清中肝癌(HCC)特异性AFP(AFP-L3)。方法用小扁豆凝集素(LCA)亲和层析柱分离血清中AFP-L3,放射免疫法测定AFP及AFP-L3。结果肝癌患者血清经LCA-Sepharose4B亲和层析柱分离和含α-甲基-D-甘露糖苷的解吸液洗脱可得到AFP-L3。以AFP-L3在总AFP中所占百分比≥15%作为临界值,本法诊断HCC的敏感性为92·7%,特异性为88·2%。结论该法特异性强、敏感性高、重复性好,且方便、经济,为临床早期诊断肝癌的有用指标。

免疫亲和层析-液质联用法检测蓝藻中的微囊藻毒素

应用自制的微囊藻毒素(microcystin,MC)免疫亲和层析柱为净化工具,建立了固相萃取柱富集、免疫亲和层析柱净化、液质联用法检测蓝藻样品中MC的方法。结果显示:只用固相萃取柱富集,会残留大量杂质,干扰MC(尤其是MC-LR)的测定结果。而用免疫亲和层析柱净化能有效去除藻样中的杂质,排除干扰,通过液质联用法定量,能准确测定藻样中的微囊藻毒素-RR(MC-RR)和-微囊藻毒素-LR(MC-LR)。方法的检出限为2.5μg/L;线性范围为5～500μg/L;MC-RR和MC-LR平均回收率高于84%;相对标准偏差低于5%。

金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究

金属螯合亲和层析是近 2 0年发展起来的一项新型分离技术。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点 ,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。本文从单组分蛋白质入手 ,考查了 pH值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响 ,并进行了分析。还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究 ,比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别 ,为实际体系的分离研究打下了基础。

凝血酶的亲和层析纯化技术

以新鲜猪血为原料 ,采用离心、激活、沉淀等技术提取出粗凝血酶 ,利用化学方法将分子量范围在 6KD左右的肝素连接到经溴化氰活化的 Sepharose CL- 6B树脂上 ,制成亲和树脂 ;采用亲和方法 ,从粗酶中纯化得到猪凝血酶。活性测定表明 ,在保持酶的底物专一性的同时 ,凝血酶的比活上升了 32 .5倍左右。计算总活力回收率约 5 0 .6%。同时对肝素亲和层析柱的制备以及洗脱方法进行了探讨。

分离纯化新技术亲和层析

本文介绍了亲和层析的一般问题 ,综述了固定化金属亲和层析。

以壳聚糖为亲和层析载体提纯胰蛋白酶

以自制的壳聚糖为亲和层析载体,鸡蛋粘蛋白作配基,通过戊二醛交联构建成亲和吸附剂,对胰蛋白酶的亲和层析提纯进行了研究。结果表明,胰蛋白酶活性回收率达70％,纯度经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为一条带,实验有操作安全、简单、快速和收率高等优点。

三种亲和层析体系纯化大豆凝集素的比较研究

用N-乙酰基-D-半乳糖胺-epoxy-Sepharose 6B、半乳糖胺-CH-Sepharose 4B和瓜尔胶三种亲和层析体系对大豆中的凝集素进行分离提纯,并进行了多方面的比较。结果显示:三种亲和层析体系纯化大豆凝集素的产率存在显著差异,依次分别为147±15、110±12和128±16mg/100g生大豆;三种亲和胶的亲和饱和度差异显著,分别为12.2±1.4、7.5±1.3和2.1±1.6 mg/mL凝胶。这一结果表明大豆凝集素最理想的纯化方法是N-乙酰基-D-半乳糖胺-expoxy-sepharose 6B亲和层析体系。

联合应用配体和单克隆抗体亲和层析纯化人血浆天然MBL蛋白

目的优化从人血浆分离纯化天然甘露聚糖结合凝集素(MBL)的方法。方法联合应用甘露聚糖-Sepharose 4B层析柱和抗人MBL-CRD单克隆抗体-Sepharose 4B层析柱,3次上柱亲和层析分离,分别用EDTA、D-甘露糖、Gly-HCl(pH2.4)溶液洗脱结合蛋白。以SDS-PAGE、Western blot和ELISA等技术鉴定纯化产物。结果所获纯化MBL为Mr28000和Mr32000肽链构成的功能性寡聚体,其纯度较高,可与配体甘露聚糖结合并有效凝集酵母菌,还能与U937细胞胶凝素受体结合。结论联合使用配体亲和层析和单克隆抗体亲和层析从血浆中分离纯化MBL,获得高纯度、高活性的天然MBL蛋白。

亲和层析技术在现代蛋白质研究中的应用及新发展

亲和层析技术是目前重要的蛋白质研究技术之一。本文介绍了免疫亲和层析、凝集素亲和层析、核酸亲和层析、金属螯合亲和层析以及染料配体亲和层析等几类常规亲和层析的原理及在蛋白质分离纯化以及分析鉴定方面的应用;简要叙述了当今蛋白质组研究中新出现的两种与亲和层析有关的技术,串联亲和层析技术和SELDI芯片技术。并且提出了存在的问题以及今后发展趋势。

赤子爱胜蚓纤维蛋白溶解酶的亲和层析纯化和生化特性

用慈菇蛋白酶抑制剂Sepharose 4B亲和层析方法从蚯蚓丙酮粉抽提液中得到较高纯度和活性的蚯蚓纤维蛋白溶解酶(纤溶酶)制剂。经快速蛋白质液相色谱(FPLC)分析,内含9个纤溶活性峰。对其中第九峰进行电泳测定,为单一条带,分子量为27000,还测定了其氨基酸组成,糖含量及酶的底物特异性。

血红素亲和层析快速纯化香椿子抗氧化活性蛋白

以蛋白质含量、总还原力和DPPH清除能力为指标,对盐析法、碱提酸沉法、直接加热法进行评价,选取蛋白含量高同时有较强还原力的碱提酸沉提取法。将环氧氯丙烷活化血红素偶联于Sephadex G-25制作亲和层析柱,以水为平衡液、Na Ac-HAc缓冲液为洗脱液进行香椿子蛋白纯化,考马斯亮蓝法测定所得蛋白纯度,并对其进行初步抗氧化研究。结果表明:目标产物蛋白具有较好的DPPH清除能力,含量由59.51%提高至96.23%,纯化后蛋白纯度得到显著提高(P<0.05)。

铜离子螯合亲和层析纯化人铜锌超氧化物歧化酶

用铜离子螯合亲和层析对人红细胞铜锌超氧化物歧化酶进行了纯化．３次实验的结果表明，此项层析具有重复使用率高和蛋白结合量大的显著优点．提纯的人铜锌超氧化物歧化酶的比活性为３０３７Ｕ每毫克蛋白，并经活性染色和ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳证实其纯度均一．纯化中，探索了用紫外２６０ｎｍ与２８０ｎｍ的Ａ比值判断酶纯度的简便方法．

亲和层析法分离纯化链激酶

采用自制的酰基化－Ｐｌｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析分离纯化链激酶，ＮＰＧＢ作为酰化剂，８ｍｏｌ／Ｌ尿素进行洗脱，纯化约９倍，收率９０％以上，比活为７４０００Ｕ／ｍｇ蛋白质，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示链激酶分子量为４７０００，未发生降解。ＮＰＧＢ酰化稳定，一次酰化后可反复使用２０余次。

亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的 :纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAgFab抗体 ,建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法 :以原核表达的重组人源性抗HBsscFv免疫BALB/c小鼠 ,经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株 14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水 ,经辛酸沉淀纯化后 ,制备亲和层析柱 ,纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAgFab抗体。结果 :用抗scFvmAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAgFab的纯度可达 95 %以上 ,回收率可达 70 %～ 85 %。结论 :人源性抗HBsscFv制备mAb作为亲和层析的介质 ,可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAgFab,适用于大规模生产重组人源性抗HBsAgFab。

纤维素亲和层析膜用于去除医药制剂中的内毒素

以纤维素膜为基质 ,活化后 ,键合壳聚糖配基 ,制备成亲和层析膜介质 .考察了所制备的膜介质在不同离子强度I、pH、流速条件下对内毒素的去除效果 .结果表明 ,在离子强度为0 1～ 0 4 ,pH值 6～ 8,流速 2～ 6mL/min范围内去除效果最佳 .将此亲和层析膜介质用于去除人血白蛋白溶液、氢化可的松注射液、右旋糖苷 4 0葡萄糖注射液中的内毒素 ,去除率在95%左右 ,用于去除溶菌酶溶液、盐酸丁卡因注射液中的内毒素 ,去除率在 80 %以上 .