下调Chk1和Chk2基因促进射线照射后HeLa细胞凋亡

目的探讨下调Chk1和Chk2基因对HeLa细胞射线照射后细胞周期和凋亡的影响及其作用机制。方法应用流式细胞仪检测不同剂量^60Co照射引起的HeLa细胞周期和凋亡的动力学变化，以激光共聚焦显微镜和Western blot法检测转染Chk1和Chk2正义寡核苷酸（sODN）和反义寡核苷酸（AsODN）对Chk1和Chk2蛋白表达的影响，以AnnexinV—PI法、凋亡细胞的周期特异性检测法及透射电镜观察单独或联合转染Chk1和Chk2反义寡核苷酸对射线照射后HeLa细胞凋亡的影响。结果不同剂量的^60Co照射可引起HeLa细胞不同程度的G2／M期阻滞，15 Gy的^60Co照射48h后，G2／M期细胞可达75．53％±3．72％。当细胞周期阻滞解除后，细胞凋亡明显增加。转染Chk1 AsODN组的早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞共有94．42％±4．78％，明显高于转染Chk1 sODN组（44．35％±2．08％，P〈0．0001）；转染Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有93．08％±5．24％，明显高于转染Chk2 sODN组（48．98％±-3．35％，P〈0．0001）；而共转染Chk1和Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有94．26％±4．92％，明显高于共转染Chk1和chk2 sODN组（42．46％±2．56％，P〈0．0001）；共转染Chk1和chk2 AsODN组与仅转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。凋亡细胞的周期特异性检测结果显示，转染Chk1和Chk2 sODN引起的凋亡主要来自于G1期细胞，而转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN后，G1期、S期、G2／M期的凋亡细胞均较对应sODN转染组明显增加，尤其共转染Chk1和Chk2 AsODN组更为显著。结论射线照射激活细胞周期检测点信号传导通路引起细胞自我保护，是临床上产生放疗抵抗的主要原因，而阻断该信号通路的关键激酶Chk1或Chk2，可显著增强细胞的放射敏感性，其机制在于改变了凋亡细胞的周期特异性，凋亡细胞可以来自G1、S、G2／M各周期的细胞。

chk2反义寡核苷酸对顺铂作用下HeLa细胞凋亡的影响

目的观察宫颈癌HeLa细胞转染chk2反义寡核苷酸后,在顺铂作用下对凋亡的影响。方法采用MTT法检测不同浓度顺铂作用人宫颈癌细胞株HeLa 24、487、2 h后对细胞的生长抑制率。以脂质体为载体将chk2正义链和反义链转染HeLa细胞,用Western blot检测HeLa细胞中Chk2蛋白的表达,用流式细胞仪和TUNEL法检测顺铂作用后细胞凋亡率。结果顺铂对HeLa细胞有生长抑制作用,并有时间和浓度依赖性;反义chk2转染后可明显抑制Chk2蛋白表达(P<0.01),顺铂作用下细胞凋亡率明显高于转染正义链组(P<0.01)。结论反义寡核苷酸封闭chk2基因可增加HeLa细胞对顺铂的凋亡敏感性。

chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响

目的:观察卵巢癌SKOV-3细胞转染chk2反义寡核苷酸后在顺铂作用下细胞凋亡的变化.方法:用MTT法检测不同浓度顺铂对SKOV-3细胞的抑制率,Western Blot法检测SKOV-3细胞中Chk2蛋白的表达.流式细胞仪及TUNEL法检测转染chk2反义寡核苷酸后顺铂作用下SKOV-3细胞凋亡情况.结果:顺铂对SKOV-3细胞的生长抑制率随浓度增高和时间延长而升高.Western Blot法检测证实转染chk2反义寡核苷酸后SKOV-3细胞中Chk2蛋白表达受到明显抑制.流式细胞仪检测抑制chk2基因表达后SKOV-3细胞凋亡率为(77.6±1.7)%,明显高于正常组(24.7±1.76)%,空脂质体组(35.6±1.4)%及转染正义寡核苷酸细胞组(47.6±1.2)%.TUNEL法检测结果与流式细胞法一致.结论:chk2可作为卵巢癌增敏治疗的有效靶点.

Chk2反义寡核苷酸对放射线照射诱导的HeLa细胞凋亡的影响

目的:观察宫颈癌细胞HeLa转染chk2反义寡核苷酸后,在X射线作用下对凋亡的影响。方法:以脂质体为载体将chk2正义链和反义链转染HeLa细胞,用Western blot检测HeLa细胞中Chk2蛋白的表达,用流式细胞仪和TUNEL法检测X射线照射后细胞凋亡率。结果:反义封闭chk2可明显抑制Chk2蛋白表达(P<0.01),X射线作用下细胞凋亡率明显高于转染正义链组(P<0.01)。结论:反义封闭chk2基因可增加He-La细胞对X射线照射的凋亡敏感性。

Chk1和Chk2高表达人胃癌BGC823细胞的建立与鉴定

细胞周期检测点Chkl和Chk2在参与G2/M期起着重要作用,本研究构建Chk1/2的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌BGC823细胞,进一步证明Chk1/2高表达对BGC823细胞G2/M期的影响。根据NCBI Gen Bank Chk1/2基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点。从人胃癌细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序对重组质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染BGC823细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot检测表达产物。结果显示,菌落特异性PCR表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,经测序与NCBIBLAST分析证实为Chk1和Chk2基因。稳定转染空载体pcDNA3.1的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的BGC823细胞,经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在BGC823细胞中的表达较对照组与空载体组明显增加(P<0.05)。流式细胞术检测显示,Chk1转染组G2/M细胞较对照组与空载体组明显增加(P<0.05),而Chk2转染组G2/M细胞无明显差异(P>0.05)。上述结果表明,成功构建pcDNA3.1/Chk1与pcDNA3.1/Chk2真核表达载体和Chk1与Chk2高表达的BGC823细胞,Chk1高表达可阻滞BGC823细胞于G2/M。

Chk1/2反义寡核苷酸对顺铂诱导的A549细胞生物学行为的影响

目的观察顺铂作用下A549细胞的细胞周期变化规律和Chk1、Chk2(Chk1/2)反义寡核苷酸(AsODN)对顺铂(DDP)诱导的A549细胞生物学行为的影响。方法流式细胞术SubG1法检测DDP作用下A549细胞周期和凋亡的动力学变化;蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测转染Chk1/2AsODN后Chk1/2蛋白的表达;流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC法和SubG1法检测转染Chk1/2AsODN后DDP作用下的细胞周期和凋亡变化。结果10μmol/LDDP作用12h后A549细胞出现明显的S期阻滞,Chk1/2AsODN对A549细胞中Chk1/2蛋白表达有明显抑制作用,转染Chk1/2AsODN可显著增加DDP诱导下A549细胞的凋亡率约200%～300%,而联合转染Chk1/2AsODN与单转染相比,凋亡无明显增加(P>0.05)。转染Chk1/2AsODN引起化疗增敏的机制是通过解除S期阻滞这种肿瘤细胞的自我保护机制实现的。结论Chk1/2可作为肺癌化疗药物增敏治疗的有效靶点,灭活Chk1/2基因可以显著增强肿瘤细胞化疗的敏感性。

灭活Chk1／2基因增强H4细胞放疗后凋亡敏感性

目的观察反义封闭Chk1和／或Chk2基因，阻断细胞周期检测点信号传导通路对胶质瘤H4细胞放疗后细胞周期和凋亡的影响，评价Chkl和Chk2基因作为肿瘤治疗靶点的有效性。方法流式细胞仪检测不同剂量^60Co照射引起的H4细胞周期和凋亡的动力学特点，以建立G2／M期细胞周期阻滞模型；Western blot法检测转染Chk1和Chk2正、反义寡核苷酸后，细胞内Chk1和Chk2蛋白表达；Annexin V—PI法检测单转染或联合转染Chk1／2反义寡核苷酸对放疗后H4细胞凋亡的影响。结果不同剂量的^60Co照射可引起H4细胞G2／M期阻滞，以10Gy^60Co照射12h G2／M期阻滞最明显；单独反义封闭Chk1或Chk2基因可增强放疗后凋亡敏感性100％-200％，而同时反义封闭Chk1和Chk2基因具有协同作用，增强放疗后凋亡敏感性300％，其机制是通过解除G2／M期阻滞实现的。结论放疗可激活细胞周期检测点信号传导通路导致放疗抵抗，而阻断该信号通路的关键激酶Chk1和Chk2可显著增强放疗后凋亡敏感性。

顺铂作用于宫颈癌HeLa细胞致细胞周期调节因子变化及对细胞周期的阻滞作用

目的:探讨细胞周期调节因子atm,chk2,p53基因在顺铂(DDP)诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡中的作用.方法:MTT法检测梯度浓度DDP对HeLa细胞的生长抑制率,RT-PCR法和Western Blot法检测DDP作用前后HeLa细胞atm,chk2及p53 mRNA和蛋白的表达.流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的变化.结果:DDP对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制作用具有浓度和时间依赖性.DDP作用HeLa细胞后atm,chk2,p53 mRNA和蛋白的表达均增强,细胞凋亡增加,细胞周期阻滞于G2/M期(P<0.05).结论:atm,chk2,p53基因与细胞凋亡及G2/M期阻滞有关.干预atm,chk2,p53基因通路有望成为宫颈癌化疗增敏的新策略.

chk1、chk2反义寡核苷酸转染HL-60细胞株增加其放疗后凋亡敏感性

目的 通过反义封闭chk1、chk2基因 ,阻断细胞周期检测点信号传导通路 ,从而增加HL 6 0细胞放疗敏感性。方法 对HL 6 0细胞进行chk1、chk2正义链和反义链的单转染与共转染 ,于转染后 2 4h进行放射线照射 ,照射后 2 4h用Westernblot测量chk1蛋白的变化 ,用流式细胞仪测定细胞周期及细胞凋亡率。结果 反义封闭chk1可增加HL 6 0细胞放疗后凋亡敏感性 ,细胞凋亡率为 2 6 .31%,明显高于正义链的 10 .34%,二者比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。转染chk1反义链的HL 6 0细胞G2 /M期阻滞现象减弱 ,G2 /M期细胞为 38.42 %,转染chk1正义链为 5 4.6 4%,二者比较差异有显著性 (P <0 0 1)。联合反义封闭chk1、chk2具有协同增效作用。结论 反义封闭chk1、chk2基因可增加HL 6 0细胞放疗后凋亡敏感性。

灭活细胞周期检测点激酶增强乳腺癌细胞放疗敏感性

目的:乳腺癌是严重威胁妇女健康的重要疾病,放疗常常作为乳腺癌综合治疗的重要手段。研究表明,临床上产生放疗抵抗的主要原因是由于放疗激活细胞周期检测点信号传导通路引起细胞自我修复而逃避凋亡,因而目前通过抑制细胞周期检测点信号通路增强肿瘤放、化疗敏感性,已成为国际上抗肿瘤治疗的一个重要方向和研究热点。Chk1和Chk2是细胞周期检测点中最重要的丝氨酸/苏氨酸激酶,本研究通过反义封闭Chk1和/或Chk2基因,阻断细胞周期检测点信号传导通路,研究对乳腺癌MDA-MB-231细胞放疗后细胞周期和凋亡的影响,从而评价Chk1和Chk2基因作为肿瘤治疗靶点的有效性。方法:Western-Blot法检测转染Chk1和Chk2正、反义寡核苷酸后,细胞内Chk1和Chk2蛋白表达情况;流式细胞仪AnnexinV-PI法和SubG1法检测单转染或联合转染Chk1/2反义寡核苷酸对放疗后MDA-MB-231细胞凋亡和细胞周期的影响。结果:反义封闭Chk1或Chk2基因可解除G2/M期阻滞,增强放疗后凋亡敏感性,而同时反义封闭Chk1和Chk2基因具有协同作用。结论:阻断细胞周期检测点信号通路的关键激酶Chk1和Chk2可显著增强放疗后凋亡敏感性。