CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定

以CAT（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）为报告基因,构建p CAT2启动子探针载体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子。Sau3AⅠ酶切铜绿假单胞菌的基因组,回收（500-1 500 bp）片段并与p CAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库,PCR鉴定文库的多样性,利用氯霉素（10μg/m L）和卡那霉素（50μg/m L）双抗平板筛选了16株阳性菌株,并用PCR、测序、NCBI比对进行鉴定。构建的基因文库的库容量可达50 000个,覆盖基因全长的3.5倍,插入率达90%,具有较强的随机性。采用双抗平板进行启动子的筛选,筛选效率高达96%。获得了绿脓杆菌基因组中的9个启动子,同源性达99%以上,并对其活性进行初步鉴定,为铜绿假单胞菌基因表达调控的进一步研究奠定基础。

氯霉素乙酰转移酶检测(CAT assay)

本文介绍一种快速方便的外源基因在哺乳动物细胞中瞬间表达检测系统,即氯霉索乙酰转移酶检测系统。该项检测技术不仅对基因的调控顺序(Cis-acting elements)如启动子、增强子等检测提供了有效的工具,而且为真核基因在哺乳动物细胞表达体系中,质粒的构建及筛选提供了行之有效的手段。并介绍了该技术的全过程及其操作要点。

氯霉素抗性融合蛋白报告系统的建立与验证

利用氯霉素乙酰基转移酶(CAT)N端融合了可溶性蛋白细胞所表现出的氯霉素抗性高于不溶性蛋白这一特点,建立了一种能在大肠杆菌中方便地检测到目的蛋白可溶性的报告系统。以pMalp2X高效表达载体为基础,采用PCR法扩增CAT基因,并通过引物向CAT中引入所需的多克隆位点、终止密码子及linker,将扩增得到的CAT片段插入到pMalp2X中,构建pCAR报道质粒并作测序鉴定;PCR分别扩增IGF1、IL3、Trx基因,连接到pCAR载体上,导入大肠杆菌原核表达系统中进行诱导表达,SDSPAGE分析、氯霉素抗性试验对表达目的蛋白的可溶性和表现出的氯霉素抗性的相关性加以验证。结果显示用该载体表达的重组蛋白的可溶性与氯霉素抗性具有很强的相关性。本报告系统能通过直观的平板氯霉素抗性高低正确指示位于CATN端的目的蛋白的可溶性,为其在生物工程和蛋白质构象相关疾病研究等领域的应用打下了基础。

重组人TGF-β1对TGF-β1基因启动活性的影响

目的:探讨TGF β1对人TGF β1基因自身启动子活性的影响。方法:以人全血基因组DNA为模板,PCR扩增获得TGF β1基因转录起始位点上游5′端- 132 8～+812bp和+2 2 7～+812bp的片段,以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因而不含启动子的pCAT enhancer质粒构建成重组质粒,并将其转染至大鼠星状细胞株nFSC中,细胞在DMEM培养基中进行培养,用不同浓度的TGF β1进行干涉,测定并比较细胞的CAT表达水平。结果:不同浓度的TGF β1对大鼠的肝脏星状细胞的增殖具有抑制作用,而且这种抑制作用在实验用的浓度范围内具有剂量依赖关系;浓度为2 5ng/mlTGF β1可以使转染phTGF0 5 85、phTGF1 12 0、phTGF1 4 2 3、phTGF1 6 80、phTGF2 14 0质粒的大鼠肝星状细胞的CAT活性分别增加2～5倍。结论:TGF β1在大鼠nFSC细胞中对TGF β1启动子活性具有自身促进作用,为进一步研究TGF β1的调节机制提供了依据。

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的初步研究

抗药性细菌对生态环境、养殖业以及人类健康构成严重威胁。以大连海参、海胆养殖场多抗性细菌筛选为基础,采用分子生物学手段对40株抗性细菌进行了氯霉素、土霉素及氟氯霉素抗性基因检测,探讨抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础。

一种亨廷顿舞蹈症体外药物筛选细胞模型的建立

为建立以多聚谷氨酰胺(polyQ)为靶点的亨廷顿舞蹈症体外药物筛选细胞模型,以随机引物PCR法克隆了不同长度的CAG片段,经序列测定正确后,分别融合到已经建立的氯霉素抗性融合蛋白表达系统pCAR中CAT的N端。重组质粒转化大肠杆菌,并在其中诱导表达,SDS-PAGE和氯霉素抗性平板试验对目的蛋白可溶性与氯霉素活性进行测定。结果显示长度在40以上的polyQ为不溶性包涵体表达,表现为低水平的氯霉素抗性,40以下的polyQ则以可溶形式表达,表现为高水平氯霉素抗性,从而建立起能够模拟亨廷顿舞蹈症病理过程的体外细胞模型。通过检测模型细胞的氯霉素抗性,可以定性、定量地反映polyQ在体内的折叠状态和可溶性,故可以借助该模型对促溶药物或生物活性物质进行高通量筛选,为亨廷顿舞蹈症预防、诊断、治疗提供了新思路。

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的筛选

由于抗生素药物的大量使用和相当程度的滥用,使得水产病原菌耐药性十分严重,多重药物抗性细菌也时有发生,大大增加了微生物病害防治的难度。为探讨抗性细菌的抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础,本研究以大连海参、海胆养殖水体多抗性细菌筛选为基础,利用分子生物学方法对这些抗性细菌进行了土霉素、氯霉素及氟氯霉素抗性基因的筛选。研究发现,大部分耐药细菌都携带多种抗性基因,证明它们的耐药性都是由相应抗性基因决定的。

多种细胞因子对转化生长因子β_1转录的调控作用

目的:探讨细胞因子TNF-α、IFN-γ、IFN-α、PDGF-BB、bFGF对TGF-β1启动活性的影响。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增获得含有人TGF-β1基因启动子序列的-1328～+812bp片段,与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因构建重组体phTGF2.14,将其瞬时转染大鼠nFSC细胞,加入细胞因子进行干预,测定CAT活性。结果:10ng/mlTNF-α可以使重组体的CAT活性升高3.24倍;浓度为1000U/ml的IFN-γ、IFN-α使phTGF2.14的CAT活性分别降低至对照的(42±12)%、(58±6)%;浓度为10ng/ml的PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的活性没有影响;IFN-γ、IFN-α和TNF-α联合应用TGF-β1基因启动子的活性分别为对照的1.32和1.46倍。结论:TNF-α可促进TGF-β1基因启动子的活性;IFN-γ、IFN-α则对TGF-β1基因启动子的启动活性有抑制作用;IFN-γ、IFN-α可以阻断TNF-α对TGF-β1基因启动子的促进作用;PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的启动活性无影响,此研究为进一步研究细胞因子在纤维化疾病的相互作用机制提供了依据。

以CAT为报告基因的蜡样芽孢杆菌强组成型启动子的筛选及初步鉴定

目的从蜡样芽孢杆菌基因组中筛选组成型启动子，并对其活性进行鉴定。方法用Sau3AI酶切蜡样芽孢杆菌的基因组，回收片段，连接载体pCMR8a，转化DH5ct感受态后涂布在氯霉素和卡那霉素的培养基上得到强启动子，并对其进行截短和顺反性实验，并检测其启动蛋白表达情况。结果成功筛选到一个具有反向启动外源蛋白表达能力的启动子序列，并能够有效表达多种外源蛋白。结论本实验成功筛选并验证了蜡样芽孢杆菌的一种组成型启动子，能够有效地启动外源蛋白的表达．对实验室中表达某种或某些蛋白和工业生产提供了更多的选择。