CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定

以CAT（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）为报告基因,构建p CAT2启动子探针载体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子。Sau3AⅠ酶切铜绿假单胞菌的基因组,回收（500-1 500 bp）片段并与p CAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库,PCR鉴定文库的多样性,利用氯霉素（10μg/m L）和卡那霉素（50μg/m L）双抗平板筛选了16株阳性菌株,并用PCR、测序、NCBI比对进行鉴定。构建的基因文库的库容量可达50 000个,覆盖基因全长的3.5倍,插入率达90%,具有较强的随机性。采用双抗平板进行启动子的筛选,筛选效率高达96%。获得了绿脓杆菌基因组中的9个启动子,同源性达99%以上,并对其活性进行初步鉴定,为铜绿假单胞菌基因表达调控的进一步研究奠定基础。

郑州市宠物猫源病原菌毒力基因检测及其耐药性分析

为了解宠物猫源病原菌常见毒力基因的携带情况及其对临床常用抗菌药物的耐药性,采集宠物医院住院猫的鼻拭子、咽拭子和肛拭子进行病原菌的分离纯化、16S rRNA鉴定,通过PCR扩增检测毒力基因,并通过最低抑菌浓度(MIC值)测定判断药物敏感性及耐药性。共分离到16株大肠杆菌、8株葡萄球菌、3株沙门氏菌和14株肠球菌。16株大肠杆菌中毒力基因OmpA检出率最高,达到100%(16/16);≥43.75%的猫源大肠杆菌对头孢噻呋、头孢喹肟、多西环素和氟苯尼考耐药;8株葡萄球菌未检测到毒力基因,≥87.50%的葡萄球菌对头孢噻呋、头孢喹肟、多西环素、庆大霉素和阿米卡星耐药;2株沙门氏菌检测到fliC、gipA、mgtC毒力基因,3株沙门氏菌全部对多西环素、庆大霉素、黏菌素耐药,且2株检测到mcr-1 COL耐药基因;14株肠球菌中毒力基因efaA检出率最高,为78.57%(11/14),≥92.86%的菌株对头孢噻呋和阿米卡星耐药。宠物猫源病原菌除葡萄球菌外均携带多种毒力基因,耐药性突出且存在多重耐药性,对替加环素和黏菌素的耐药机制疑是水平传播所致。

带有氯霉素抗性基因标记的重组布氏杆菌S2的构建及其生物学特性

无法区分免疫接种和自然感染是限制布氏杆菌疫苗应用的主要原因。本研究通过基因同源重组技术,用氯霉素抗性基因(Cmr)替代布氏杆菌弱毒S2株的WbkC基因,筛选获得重组布氏杆菌rS2-WbkC株。试验发现,重组菌rS2-WbkC由原先的光滑型转变成粗糙型。rS2-WbkC在TSA培养基上传25代后仍能稳定表达氯霉素抗性蛋白。小鼠动物试验模型表明,rS2-WbkC与S2有相似的保护性,但rS2比S2具有更高的安全性。rS2-WbkC免疫小鼠后,其抗血清可通过平板凝集试验与S2免疫的血清相区分。本研究为布氏杆菌标记疫苗的研制提供了技术平台。

大肠杆菌氯霉素类耐药基因三重PCR检测试剂盒的研究与应用

本研究研制了大肠杆菌氯霉素类药物耐药基因cat1、flor、cmlA基因三重PCR检测试剂盒。结果显示,该试剂盒具有良好的重复性、灵敏度以及保存期长等特点。应用该试剂盒检测107株猪源鸡源大肠杆菌,cat1、flor、cmlA三种基因的检出率分别是41.1%、51.4%和36.4%。本试剂盒对氯霉素类药物耐药基因的传播、流行调查以及在临床用药方面具有重要的指导意义。

耐氯霉素肠球菌乙酰转移酶基因检测及同源性分析

目的检测耐氯霉素肠球菌乙酰转移酶(CAT)基因,并对耐氯霉素肠球菌进行同源性分析,为临床治疗与预防提供依据。方法根据美国临床实验室标准化研究所(CLSI)指南做药敏试验,用PCR方法检测CAT基因,并测序;用重复基因外回文序列-聚合酶链反应(REP-PCR)对耐氯霉素肠球菌进行基因分型;用Cross Checker软件和SPSS11.0软件对指纹图谱进行同源性分析。结果耐氯霉素肠球菌分离率为21.9%;30株耐氯霉素肠球菌均检测出CAT基因,对复方新诺明和克林霉素均100.0%耐药,其耐药率为红霉素86.7%、高浓度庆大霉素为66.7%、高浓度链霉素为86.7%、达福普汀为90.0%、四环素为93.3%;有3组粪肠球菌、2株屎肠球菌各具有100.0%同源性。结论耐氯霉素肠球菌对多种抗菌药物耐药;CAT基因介导了肠球菌属对氯霉素的耐药;REP-PCR是一种操作简便、快速、低廉的肠球菌基因分型方法。

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的初步研究

抗药性细菌对生态环境、养殖业以及人类健康构成严重威胁。以大连海参、海胆养殖场多抗性细菌筛选为基础,采用分子生物学手段对40株抗性细菌进行了氯霉素、土霉素及氟氯霉素抗性基因检测,探讨抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础。

海洋病原细菌的氯霉素耐药菌株筛选鉴定及质粒消除

目的从污染海域筛选非临床氯霉素耐药株,研究耐药基因定位及耐药机制多样性。方法TCBS和EMB选择平板筛选,结合16SrDNA序列分析鉴定耐药株。MIC测定、基因组DNA-RAPD分型和质粒消除评估多样性。结果评估187株氯霉素耐药株的MIC值分布、属种分布、耐药基因定位及耐药机制。发现80株耐药MIC25～128μg/ml是CLSI/NCCLS(1995年)定义临床标准(MIC12.5μg/ml)的2～10倍,分布在弧菌科和肠杆菌科主要属种;58株MIC>25μg/ml基因组DNA-RAPD分型与菌落表型分组结果吻合,显示多样性丰富。采用多轮高温(～43℃)和高浓度(～1%)SDS双重处理和交替培养,77株MIC>25μg/ml分离株的质粒消除效率为28.6%;55株不能消除耐药表型,暗示染色体编码耐药基因;22株可消除氯霉素耐药表型,其中16株完全消除,暗示质粒独立编码耐药基因,6株部分消除,暗示质粒和染色体分别编码耐药基因。结论来自污染海域环境的非临床氯霉素耐药株可作为新模型,提供耐药基因定位及耐药机制多样性的新视野。

猪源大肠埃希菌氯霉素类抗生素主要耐药基因的检测与分析

为查明辽宁地区猪源大肠埃希菌氯霉素类耐药菌株主要耐药基因的流行及分布情况,为猪大肠埃希菌病的防控提供科学依据,采用聚合酶链反应(PCR)对25株氯霉素类耐药菌株进行cat1、cmlA基因检测,并对cat1和cmlA基因进行序列分析。通过对耐药基因的检测发现,cat1、cmlA基因的检出率分别为32%和84%,8株同时检出cat1和cmlA基因。因此,在辽宁地区cmlA基因在猪源大肠埃希菌耐药菌株中普遍存在,cmlA介导的泵出机制是辽宁地区氯霉素类抗生素产生耐药性的主要原因;其次为cat1基因,与氯霉素乙酰转移酶的灭活有关。

重组人TGF-β1对TGF-β1基因启动活性的影响

目的:探讨TGF β1对人TGF β1基因自身启动子活性的影响。方法:以人全血基因组DNA为模板,PCR扩增获得TGF β1基因转录起始位点上游5′端- 132 8～+812bp和+2 2 7～+812bp的片段,以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因而不含启动子的pCAT enhancer质粒构建成重组质粒,并将其转染至大鼠星状细胞株nFSC中,细胞在DMEM培养基中进行培养,用不同浓度的TGF β1进行干涉,测定并比较细胞的CAT表达水平。结果:不同浓度的TGF β1对大鼠的肝脏星状细胞的增殖具有抑制作用,而且这种抑制作用在实验用的浓度范围内具有剂量依赖关系;浓度为2 5ng/mlTGF β1可以使转染phTGF0 5 85、phTGF1 12 0、phTGF1 4 2 3、phTGF1 6 80、phTGF2 14 0质粒的大鼠肝星状细胞的CAT活性分别增加2～5倍。结论:TGF β1在大鼠nFSC细胞中对TGF β1启动子活性具有自身促进作用,为进一步研究TGF β1的调节机制提供了依据。

多重耐药大肠埃希菌菌株氯霉素耐药相关基因研究

目的了解多重耐药大肠埃希菌（ECO）对氯霉素的耐药机制。方法采用PCR法检测20株多重耐药ECO菌氯霉素耐药基因（catB，cmlA）。结果catB基因阳性3株（阳性率15％），cmlA基因阳性7株（阳性率35％）。一株catB基因PCR产物经DNA测序并翻译为氨基酸序列与已在美国国立生物信息中心[NCBI]登录的catB基因序列比对，结果为与大肠埃希菌CATB3[登录号：ABP35557]序列98％（88／89）相同，能判断为新亚型。结论该组多重耐药ECO菌对氯霉素耐药与携带catB，cmlA基因相关。

1株耐氯霉素腐败微生物的16S rRNA基因序列与碳源代谢指纹图谱分析

从污染的化妆品中分离到1株具有氯霉素抗性的革兰阴性菌213#。通过16S rRNA基因同源性比较,表明分离菌与GenBank中洋葱伯克霍尔德(Burkholderia cepacia)标准菌株同源性为100%,通过Biolog GN2MicroPlate分析该病原菌对95种碳源的利用能力,发现分离菌与Biolog数据库中的B.cepacia具有最相似的特征代谢指纹。

双歧杆菌插入失活载体的构建

目的构建双歧杆菌serpin基因插入失活载体,为探究双歧杆菌外膜蛋白Serpin功能做准备。方法在实验室前期构建的p MD18-T/serpin质粒中serpin基因片段的SacⅡ酶切位点插入氯霉素抗性基因cmr,构建双歧杆菌p MD18-T/serpincmr,插入失活载体。结果 PCR成功扩增出了氯霉素抗性基因cmr且测序结果正确;p MD18-T/serpin质粒经SacⅡ单酶切、去磷酸化后与cmr连接,通过菌落PCR、酶切验证和测序显示cmr已成功插入serpin基因片段中。结论成功构建了双歧杆菌serpin基因插入失活载体p MD18-T/serpin-cmr。

铜绿假单胞菌氯霉素耐药相关基因研究

目的了解铜绿假单胞菌（PAE）氯霉素耐药相关基因的携带状况。方法采用K-B法分别对山东（A院）、江苏（B院）二家医院PAE菌临床分离株进行抗菌药物的敏感试验。采用聚合酶链反应法（PCR）对氯霉素耐药相关基因（catB、cmlA）进行检测，并对相关基因进行序列分析。结果A院30株PAE对16种抗菌药物多药耐药；B院20株PAE对16种抗菌药物均耐药；二家医院PAE对氯霉素均不敏感。A医院30株多药耐药PAE菌catB、cmlA基因均阴性；B医院20株泛耐药PAE菌cmlA基因阳性18株（阳性率90．0％），并经测序证实；catB基因均阴性。结论不同医院PAE氯霉素耐药机制可不相同，氯霉素耐药率高的原因需进一步研究。

猫源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及其基因组的生物信息学分析

为了明确致猫呼吸道症状的病原菌及该菌的病原特征及其基因组功能信息,本研究对采集的3例发病猫的鼻腔拭子进行病原菌的分离、纯化及生化和16S rRNA基因的PCR鉴定;采用纸片法检测分离菌的药物敏感性及其对小鼠的致病性。并对其中一株分离菌进行基因组的生物信息学分析,利用不同的数据库对基因组编码的蛋白进行功能注释以及耐药和毒力相关基因的预测。细菌的分离及鉴定结果显示:分离出3株支气管败血波氏杆菌(Bb)。药敏试验结果显示,分离菌对丁胺卡那、卡那霉素、四环素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星和氯霉素敏感,对氨苄西林、链霉素、利福平、磷霉素和呋喃唑酮耐药;致病性试验结果显示,3株分离的Bb对小鼠均有一定的致病性,且浓度越高致病性越强。基因组分析结果显示,其中一株菌基因组大小为4520328 bp,GC%含量为68.12%,含有4690个蛋白质编码基因,87个tRNA基因,25个rRNA基因,1个tmRNA基因等信息;分离菌基因组编码蛋白功能的注释结果显示该菌的功能蛋白主要表现在细菌的复制增殖和生物代谢方面;分离菌携带多种耐药基因,包括主动外排系统相关基因、多粘菌素抗性基因、磷霉素抗性基因等,并基本与耐药表型一致;携带66种毒力基因,主要是分泌系统类毒力基因以及内外毒素、黏附侵袭类毒力因子基因。上述结果表明,本研究分离的Bb耐药性不强,但对小鼠呈强致病力,且含多种毒力相关基因。本研究为对该菌的研究奠定基础,并为该菌感染的防控研究提供参考。

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的筛选

由于抗生素药物的大量使用和相当程度的滥用,使得水产病原菌耐药性十分严重,多重药物抗性细菌也时有发生,大大增加了微生物病害防治的难度。为探讨抗性细菌的抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础,本研究以大连海参、海胆养殖水体多抗性细菌筛选为基础,利用分子生物学方法对这些抗性细菌进行了土霉素、氯霉素及氟氯霉素抗性基因的筛选。研究发现,大部分耐药细菌都携带多种抗性基因,证明它们的耐药性都是由相应抗性基因决定的。

乌鲁木齐市宠物猫源大肠杆菌耐药性及耐药基因检测

为了解宠物猫源大肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药性及其耐药基因携带情况,在乌鲁木齐市多家宠物医院采集宠物猫肛拭子样品59份进行大肠杆菌的分离鉴定,通过琼脂稀释法测定10种抗菌药物的最小抑菌浓度,利用PCR方法检测13种耐药基因。结果:分离鉴定出大肠杆菌47株,分离率79.7%(47/59)。分离菌对四环素(TET)(83.0%)、阿莫西林-克拉维酸(A/C)(66.0%)和磺胺异噁唑(FIS)(66.0%)耐药情况严重;对头孢他啶(TAZ)、头孢曲松(CRO)、恩诺沙星(EN)、庆大霉素(GEN)耐药率在38.3%~48.9%;对环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)敏感性较好,未检出亚胺培南耐药菌株。菌株多药耐药分布在5~8耐,占比59.6%,耐药表型以1耐TET和6耐A/C+GEN+CRO+TAZ+TET+FIS为主。共检出ant(3″)-Ia、aac(6′)-Ib、bla_(TEM)、bla_(CTX-M)、qnrS、tetA、tetB、tetM、sulⅠ、sulⅡ10种耐药基因,检出率分布在8.5%~57.4%,未检出耐药基因oqxB、bla_(NDM)、bla_(VIM),存在多种耐药基因共存现象。研究表明,乌鲁木齐市宠物猫源大肠杆菌耐药严重,且携带多种耐药基因。临床应根据细菌耐药性结果进行合理用药,并持续加强对宠物猫源大肠杆菌耐药性监测。

狐源大肠杆菌中氯霉素类抗生素耐药基因的检测

为调查东北地区狐源大肠杆菌中氯霉素类耐药菌株的耐药基因分布情况,根据其耐药表型和流行情况,指导临床上合理用药。本试验采用PCR技术对224株狐源大肠杆菌的氯霉素类耐药基因cmlA、cat和floR进行检测,并结合耐药表型进行分析。结果表明:77.23%(173/224)的狐源大肠杆菌具有氯霉素类耐药基因,cmlA、cat和floR基因在分离株的检出率分别为32.59%、43.75%和35.27%,不同来源的大多数菌株能检测出耐药基因,且有部分大肠杆菌可携带2种或3种耐药基因。

氮磷营养盐条件下大肠杆菌对氯霉素耐药性及机理研究

为探讨氮磷营养盐对环境大肠杆菌(E.coli)耐药性的影响及其机制,本试验通过建立模型生态系统研究氮磷营养盐引发大肠杆菌对氯霉素(CHL)产生耐药表型的影响,并对分离到的耐药菌株和敏感菌株进行cat基因检测。结果显示,添加不同剂量氮磷营养盐可引发大肠杆菌对氯霉素产生耐药性,46株耐氯霉素大肠杆菌cat基因的阳性率为89.13%;16株对氯霉素敏感的大肠杆菌未检出cat基因。结果表明,模拟生态系统中加入氮磷营养盐可引发大肠杆菌对氯霉素产生耐药;氮磷营养盐引发大肠杆菌对氯霉素耐药与cat基因有关。

哈维弧菌flhF和CU052_26825缺失株的构建及其生物学特性

【目的】研究哈维弧菌(Vibrio harveyi)345的GTP结合蛋白编码基因flhF和未知功能基因CU052_26825的生物学功能。【方法】利用同源重组技术构建V.harveyi 345的flhF和CU052_26825的缺失突变株,比较野生株和突变株的生长、运动性、胞外酶活性、耐药性等生物学特性以及对花鲈(Lateolabrax japonicus)的毒性。【结果】基因flhF和CU052_26825的缺失均不影响菌株的生长、运动性、胞外蛋白酶活性、对H2O2和Cu2+的压力感应、对铁的吸收利用、对大多数被测抗生素的抗性以及对花鲈的毒性;但flhF和CU052_26825缺失后对氯霉素和氟苯尼考两种氯霉素类抗生素均更加敏感。此外,flhF缺失后,细菌生物膜形成能力显著增强。【结论】flhF和CU052_26825均参与调控哈维弧菌对氯霉素类抗生素的耐药性,flhF还参与调控哈维弧菌生物膜形成。

东寨港红树林典型区域氯霉素抗性基因的分布

采用实时荧光定量PCR方法,于2017年8月采集东寨港红树林区域表层沉积物,探究氯霉素抗性基因在该区域的污染情况,同时比较红树区域密林内与密林外沉积物样品中氯霉素抗性基因的分布差异及其与环境因子之间的相关性。结果表明:该区域受氯霉素抗性基因污染严重,基因绝对丰度可高达108 copies·g-1数量级;具有不同耐药机制的氯霉素抗性基因在环境样本中具有不同的组成比例,始终以cml基因居多,证明该地区的氯霉素抗性基因的耐药机制以抗生素主动外排为主;红树林密林内的沉积物样品中氯霉素抗性基因的绝对丰度比其他样点高;氯霉素抗性基因与环境因子的相关性分析显示亚硝酸盐(NO2--N)和氯霉素抗性基因具有极显著相关性。