ctB和ure I双基因融合表达及其免疫特性分析

目的构建霍乱毒素B亚单位(CtB)和幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白(UreI)融合的原核表达质粒pET32a(+)ctB/ureI,并初步研究融合蛋白CtB/UreI的表达特性和免疫特性。方法PCR从pUC18ctB中克隆ctB基因,定向在pET32a(+)/ureI的ureI基因5′端插入ctB基因,构建ctB和ureI双基因原核表达质粒pET32a(+)ctB/ureI,转该质粒于E.coliBL-21(DE3),经酶切和序列分析鉴定工程菌。IPTG诱导表达,HP-His亲和层析纯化,SDS-PAGE和Gel-ProAnalizer4分析,重组蛋白免疫BALB/c小鼠。用Westernblot和ELISA分析重组蛋白的免疫特性。结果工程菌含完整的ctB和ureI基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。在22℃,1mmol/LIPTG诱导4h后,重组蛋白的表达占菌体总蛋白12%,亲和层析纯化后蛋白纯度为94.3%。Westernblot表明重组蛋白分别能与相应的抗体反应,该蛋白免疫小鼠后能产生相应的IgG抗体。结论成功构建了能表达CtB/UreI蛋白的大肠杆菌表达菌株。对融合蛋白表达和纯化后,初步证明了该重组蛋白有CtB和UreI的双特异反应原性和免疫原性,为研究新型幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。

幽门螺杆菌CagA蛋白与CTB融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的 构建能在水稻胚乳中特异表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)和霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物表达载体.方法 采用高保真PCR技术分别从质粒pGEM CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因,然后用PCR方法直接融合CTB基因和cagA基因.又用PCR法改造了水稻Wx启动子,在其3′端融合加入Ω序列和Kozak序列.通过一系列亚克隆最终将两个融合基因和NOS终止子插入根癌农杆菌双元载体pCAMBI A1300的表达框架内.结果 PCR验证和测序分析证明,CTB和cagA融合基因以正确的方向插入到载体pCAMBI A1300中,并位于水稻Wx启动子后.结论 成功构建CTB和cagA融合基因的植物表达载体,为幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础.

含幽门螺杆菌CagA、UreB蛋白与霍乱肠毒素B亚单位(CTB)融合基因的植物表达载体的构建及遗传转化

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生也密切相关。目前所用的疫苗制造成本高、运输费用贵,然而利用转基因植物生产的植物疫苗成本低廉、服用方便是现有疫苗的良好替代品。将Hp相关蛋白与免疫佐剂CTB的融合基因(ctb-linker-cagA和ctb-linker-ureB)利用PCR、酶切、连接等一系列方法从载体p1300-WxCLCN和p1300-WxCLUN中重组到载体pCAMBIA2301中(含35S启动子),重组载体分别命名为p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN。通过冻融法将载体导入农杆菌EHA105菌株中,以农杆菌介导的方法,将重组载体p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN转化烟草黄苗榆和心叶烟,获得了具有卡那霉素抗性再生植株,经过酶切、PCR、GUS染色和PCR-Southern鉴定结果表明,目的基因分别正确插入载体中并稳定整合到植株中,为利用植物反应器生产幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。

CTB-Aβ42融合蛋白的原核表达条件优化及鉴定

目的探索融合基因CTB-Aβ42在大肠杆菌中表达的最适条件,并纯化得融合蛋白。方法设置不同的诱导温度、诱导时间、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度,在大肠杆菌中表达融合基因CTB-Aβ42,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物,GST亲和色谱柱纯化目的蛋白,Western blot鉴定目的蛋白免疫原性。结果 SDS-PAGE结果显示,GST-CTB-Aβ42融合蛋白分子质量约为45 kD,与预期结果一致;Western blot结果表明,纯化得到的目的蛋白具有免疫原性。在诱导条件为30℃,0.1 mmol/L IPTG诱导2 h表达的可溶性蛋白所占比例最高;在37℃,0.1mmol/L IPTG诱导4 h表达的融合蛋白总量最高,小部分可溶性表达,大部分以包涵体的形式存在。结论本实验对CTB-Aβ42融合蛋白的原核表达条件进行了优化,经GST亲和色谱柱纯化获得具有免疫原性的融合蛋白。

免疫佐剂分子CTB基因的克隆与表达

我们采用聚合酶链式反应从霍乱弧菌 5 6 9B和 M0 4 5中扩增得到霍乱弧菌 B亚基基因 ,导入载体p UC18,构建重组质粒 p CTB并转化大肠杆菌 JM10 9,并用限制性酶切分析、聚合酶链式反应、序列分析、硫酸十二烷酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹进行鉴定。实验结果表明我们成功地扩增出 376 bp的霍乱弧菌 B亚基基因 ;构建免疫佐剂分子的重组质粒 p CTB;并在原核系统中表达出 12 KD的霍乱弧菌 B亚基抗原区带。

流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg的构建与细胞转染研究

目的设计并构建含分子内佐剂的流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg,初步研究其在HEK293T细胞中的转染效率。方法通过生物信息学软件设计并合成了含分子内佐剂的流感病毒多表位基因CTB-Eg,将其插入真核载体pEGFP-C2中,获得了重组质粒pEGFP-C2/CTB-Eg;用脂质体法转染HEK293T细胞,通过荧光显微镜观察和PCR法检测其转染效率。结果成功构建了真核表达质粒pEGFP-C2/CTB-Eg,且该重组质粒能在HEK293T细胞中瞬时转染,转染效率在50%～70%之间。结论本研究成功设计、构建了CTB-Eg融合基因,其在HEK293T细胞中转染效率较高,为流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg在小鼠体内的抗病毒作用研究奠定了坚实基础。

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄中表达的研究

将霍乱肠毒素 B亚单位 (CT-B)基因及内质网引导序列 (SEKDEL)克隆到质粒 p RTL2和 p BI1 2 1中 ,分别构建植物双元表达载体 p BI-CTB和 p BI-CTBK,CT-B基因由 Ca3 5 S启动子控制表达 .采用叶盘法经根癌农杆菌介导转化番茄 (金丰 1号 ,Jinfeng1 ) ,各表达载体得到一批转基因植株 .经 PCR和 Southern blot分析表明 CT-B基因整合到了番茄基因组中 ;ELISA和 Western blot分析表明 p BI-CTB和 p BI-CTBK的转基因植株能够有效表达 CT-B多肽 ,分别占番茄叶片可溶性蛋白的 0 .0 5 5 %和 0 .0 84% .

幽门螺杆菌napA-ctxB融合蛋白的基因克隆与表达

目的克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白napA与霍乱毒素B亚单位ctxB融合基因napA-ctxB(nctB),为制备预防H.pylori感染的疫苗奠定基础。方法用PCR方法扩增ctxB目的基因片段,克隆至pQE30-napA质粒的napA基因上游,构建含双基因的表达质粒pQE30-napA-ctxB(pQE30-nctB),经测序分析确认后转化E.coliDH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白NCTB,融合蛋白NCTB经镍离子柱纯化。结果PCR扩增出807bp的目的基因片段nctB。工程菌pQE30-nctB-DH5α经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr为30000,与预期的一致,约占菌体总蛋白的27%,重组蛋白用Ni2+-NTA树脂提纯,纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图象软件分析表明纯度可达94%以上。Westernblot显示重组蛋白质有良好的抗原性。结论构建含双基因的表达质粒pQE30-nctB成功,并在大肠杆菌DH5α中高效的表达。

丙型肝炎病毒抗原决定簇与霍乱毒素B亚基的融合表达以及融合蛋白的抗原性

通过固相化学合成法，合成了编码丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区和非结构区的４个抗原决定簇基因，这些抗原决定簇基因片段以不同方式串朕后与ｃｔｘＢ基因融合，构建了１２种表达不同嵌合蛋白的重组质粒。各重组质粒转化大肠杆菌后均能高效分泌性表达融合蛋白，表达产量随所融合的抗原决定簇不同在１０～５０μｇ／ｍｌ之间，表达水平主要与抗原决定簇的氨基酸组成有关，而与抗原决定簇的大小及串联次数关系不大。融合蛋白通过亲和层析纯化达到了电泳纯。对１１种融合蛋白中ＨＣＶ抗原决定簇的反应原性的研究表明，多数融合蛋白中ＨＣＶ抗原决定簇均能与对应的ＨＣＶ抗体结合。其中以融合蛋白９５０８２为抗原研制的抗－ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂具有良好的灵敏度和特异性。

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达系统的构建

霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变，在ＣＴＢ基因（ｃｔｘＢ）３′端终止密码前引入了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ，构建了质粒ｐＭＣ０５。ｐＭＣ０５中ＣＴＢ与下游ｌａｃＺ′基因阅读框架相同，转化大肠杆菌后能够表达ＣＴＢ与β－半乳糖苷酶α肽的融合蛋白；所表达的融合蛋白能与ＧＭ１结合，说明融合蛋白保持ＣＴＢ的基本高级结构和生物学活性；融合蛋白能与抗－ＣＴＢ抗体结合，说明融合蛋白具有ＣＴＢ的抗原性。以上结果表明：通过将外源抗原决定簇基因融合至ｃｔｘＢ的３′端，在大肠杆菌中表达融合蛋白，构建基因工程肽苗是可行的。还探索了转录终止序列对融合基因蛋白表达水平的影响，构建了高效表达融合蛋白的载体－宿主系统。

宋内Ⅰ相O抗原及霍乱毒素B亚基在福氏2a痢疾菌中的表达及其免疫保护效果的观察

本文利用基因重组的方法，将宋内Ｉ相Ｏ抗原基因以及霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ｃｔｘ－Ｂ）克隆至带链球菌的ａｓｄ基因的表达载体，然后转化至ａｓｄ－痢疾菌苗株福氏２ａＴ３２。脂多糖银染以及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验证实以上两基因都能在宿主菌中稳定表达。动物（小白鼠）保护实验表明，该重组菌对福氏２ａ、宋内氏痢疾菌的保护效率达１００％，对霍乱弧菌的保护效率也达７０％。该菌具有稳定、无抗生素标记、多价的特点。

霍乱毒素B亚单位胰岛素混合蛋白抗糖尿病作用

目的观察口服不同剂量霍乱毒紊B亚单位（CrB）与胰岛紊（insulin）混合蛋白疫苗的免疫耐受及预防1型糖尿病作用，为探讨社区糖尿病干预方案提供依据。方法3周龄雌性NOD小鼠60只，随机分为磷酸缓冲液（PBs）阴性对照、1mg胰岛紊阳性对照、CTB＋insulin100μg，CTB＋insulin 1mg等4组。从4周龄起，每周灌胃2次～12周龄；12周龄起，每周1次动态监测小鼠尿糖、血糖，至26周龄，观察糖尿病的发生，比较各组糖尿病发病率。结果与磷酸缓冲液（PBs）组比较，CTB＋insulin100μg。CTB＋insulin 1mg能够减少NOD小鼠糖尿病的发生，降低小鼠糖尿病的累积发病率。至鼠龄26周时，PBS组、CTB＋insulin100μg，CTB＋insulin1mg组和1mg胰岛素组的累积发病率分别为100％，60％，60％和40％，与阴性对照组比较，其他3组的累积发病率差异均有统计学意义（均P〈0．05）；2个试验组与阳性对照组的累积生存率及生存分布的差异无统计学意义。结论CTB＋insulin混合蛋白疫苗能够降低NOD小鼠糖尿病累积发病率，提高小鼠生存率；CTB＋insulin1mg组的预防作用优于100μg组。

霍乱毒素B亚基对胡萝卜的遗传转化

以胡萝卜无菌幼苗的下胚轴为外植体,通过携带CTB基因的根癌农杆菌的介导进行转化,在Kan50mg/L和Carb500mg/L的MS3-1固体培养基上诱导形成胚性愈伤组织,转至Kan100mg/L和Carb100mg/L的MS0固体培养基上形成植株,同时还进行了以经过预处理的下胚轴为外植体进行转化的试验,发现低温处理4d的下胚轴的抗性愈伤诱导率较高。经PCR检测、PCR-Southern杂交检测以后,表明CTB基因已整合进胡萝卜的基因组中。RT-PCR检测初步证明了CTB基因的转录。

pBR322-Red介导的E.coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coliW 3110染色体lacZ,lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株:CWL2、CWL4和CWL6。荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达。为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1。证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中。结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达。

霍乱毒素B亚基基因上游序列对B亚基表达水平的影响

本研究通过缺失突变和移码突变研究了ｃｔｘＢ基因上游Ａ基因部分序列对ｃｔｘＢ表达水平的影响，结果表明：（１）将霍乱毒素操纵子ＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩ片段克隆至ｐＵＣ１９，构建的质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ中Ａ亚基的部分序列不能翻译，该质粒转化大肠杆菌后ＣＴＢ的表达产量为３０μｇ／μｌ；（２）在质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ的ＸｂａＩ位点引入移码突变，构建质位ｐＭＣ０２Ｃ，使Ａ亚基基因部分序列能够翻译至自然的终止密码，Ｂ基因的表达水平却降低一倍；（３）质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ缺失ＸｂａＩ－ＣｌａＩ（５５０ｂｐ）的非翻译序列，构建质粒ｐＭＣ０３（Ａ亚基序列不翻译），该质粒转化大肠杆菌后ｃｔｘＢ基因的表达水平降低１倍；（４）在质粒ｐＭＣ０３中ｃｔｘＢ基因上游引入移码突变，构建质粒ｐＭＣ０３Ｃ，其Ａ亚基部分序列能够表达，这时ＣＴＢ的表达水平较ｐＭＣ０３低得多，较ｐＵＣ１９ＣＴＢ低２０倍以上。进一步研究表明，在ＸｂａＩ－ＣｌａＩ片段之间存在具有较强启动子活性的ＤＮＡ序列是５５０ｂｐ非翻译序列缺失后ＣＴＢ表达水平降低的原因。对Ａ基因的阅读框架变化影响ＣＴＢ表达水平的可能机理进行了讨论。

霍乱毒素B亚单位免疫佐剂的研究进展

简要介绍了霍乱毒素B亚单位 (CTB)佐剂的作用方式、免疫途径及CTB—融合蛋白的免疫原性 ,大量实验证据表明 ,CTB是一种具有良好应用前景的粘膜免疫佐剂 .

乙肝PreS_2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

本研究通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了HBV PreS_2抗原决定簇基因,与ctxB基因的3’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达30μg/ml,表达产物95％以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂GM1结合,说明融合蛋白保持了CTB的基本高级结构和生物学功能;ELISA实验证明融合蛋白具有CTB和HBV PreS_2的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品,为研究融合蛋白的免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。

乙肝PreS_2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了乙肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｓ２抗原（ＰｒｅＳ２）抗原决定簇基因，与霍乱毒素Ｂ亚基基因的３’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达，表达量达３０μｇ／ｍＬ，表达产物９５％以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂ＧＭ１结合，说明融合蛋白保持了霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）的基本高级结构和生物学功能；酶联免疫吸附实验证明融合蛋白具有ＣＴＢ和ＨＢＶＰｒｅＳ２的抗原性；应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品，为研究融合蛋白免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。

粘膜佐剂霍乱毒素B亚单位的克隆与表达

目的 :构建表达粘膜佐剂霍乱毒素B亚单位 (CTB)基因的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法 :用PCR方法从霍乱弧菌中扩增CTB片段 ,将其转入原核载体质粒pET-32a( +) ,在大肠杆菌Top10克隆 ,并在BL21中表达。结果 :重组质粒PET-CTB的全长序列经分析与基因文库公布的一致 ;表达蛋白经SDS-PAGE分析 ,相对分子量与文献相符 ;重组蛋白竟Westernblot检测有抗原性。结论 :基因重组菌表达的CTB蛋白可能作为有效。

霍乱毒素B亚单位与胰岛素原融合基因的克隆、表达及重组蛋白特性分析

构建了霍乱毒素B亚单位 (CholeratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素原 (Proinsulin)的融合基因CTB -PROIN ,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET 30a(+)中 ,获得重组质粒pETCPI,并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL2 1(DE3)中 ;重组菌株经IPTG诱导后 ,其表达产物经过 15 %SDS PAGE分析表明该菌株可以表达融合蛋白 ,其分子量约为 2 1. 6kD ,且主要以包涵体形式存在 ,约占全菌蛋白的 2 5 %。含CTB- PROIN重组蛋白的包涵体经过变性和复性后 ,CTB- PROIN可以在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果表明重组CTB PROIN蛋白可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别 ,说明该蛋白具有霍乱毒素和胰岛素的双重抗原性。同时在体外 ,CTB PROIN蛋白可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合 ,表明了该融合蛋白在体外具有生物活性。这些研究结果为利用原核生物表达系统研制廉价、高效的I型糖尿病口服疫苗奠定了基础。