内源性脉络膜新生血管抑制因子的研究进展

脉络膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV)是发达国家老年人视力损害的主要原因之一,发生机制尚不完全清楚。正常情况下,血管生成因子和抑制因子在体内处于动态平衡状态。任何原因引起血管生成因子相对或绝对增多就会导致新生血管生成。已有许多关于血管生成因子的研究报道,如碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)和血管内皮生长因子(vascularendothe-lialgrowthfactor,VEGF)等。近年陆续发现一些内源性血管抑制因子,如色素上皮衍生因子、可溶性血管内皮生长因子受体阻断剂、金属蛋白酶组织抑制因子、凝血酶敏感蛋白、软骨源性抑制因子、血管抑素和内皮抑素等。内源性血管抑制因子的抗新生血管作用为临床防治CNV相关疾病带来了新希望。

碱性成纤维细胞生长因子对人椎间盘细胞外基质合成及软骨调节素表达的影响

目的研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人椎间盘细胞基质合成能力以及血管生长抑制因子软骨调节素-1(ChM-1)表达的影响,为椎间盘退变的生物学治疗提供可供参考的生长因子。方法取4例因腰椎间盘退变性疾病而于本院行腰椎间盘切除手术患者的椎间盘组织,分别进行髓核和纤维环细胞培养及表型鉴定。取传代细胞继续培养1周后,向培养基中加入不同浓度的bFGF(0,0.1 ng/ml,1 ng/ml和10 ng/ml),72 h后收集细胞。采用Real-time RT-PCR检测各组细胞中Aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达情况;同时利用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测bFGF对ChM-1 mRNA和蛋白表达的影响。结果 bFGF可明显抑制人椎间盘细胞外基质成分Aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达(P<0.05)。Real-time RT-PCR和Western blot方法均提示bFGF可抑制ChM-1的表达水平(P<0.05),并具有剂量依赖性。结论 bFGF在发挥分解代谢功能的同时还具有潜在的促进血管生长作用。

血管新生抑制因子软骨调节素I前体蛋白的剪切加工研究

目的研究参与血管新生抑制因子软骨调节素I(ChM-I)前体加工的前蛋白转化酶(PCs)的种类及其作用,探讨ChM-I蛋白的翻译后加工成熟机制。方法构建ChM-I前体蛋白真核表达质粒并转染多种细胞,Western Blot检测细胞裂解液和培养基上清中ChM-I的表达变化;将ChM-I前体蛋白表达质粒与5种不同前蛋白转化酶表达质粒在ChM-I前体加工缺陷型细胞COS7中共表达,Western Blot检测细胞裂解液和培养上清中ChM-I蛋白的表达。结果 ChM-I前体荧光表达质粒构建成功,可在多种细胞系中表达ChM-I前体蛋白;ChM-I前体蛋白在COS7细胞中无法被有效地剪切加工成成熟ChM-I蛋白,可作为ChM-I加工缺陷型细胞使用;除PACE4以外,Furin、ΔFurin、PC5A和PC7均能显著提高培养液上清中ChM-I的含量,并缓解过量表达的ChM-I前体在细胞中的堆积。结论PCs中的Furin、PC5A和PC7能将过表达的ChM-I前体酶切加工为成熟ChM-I,提示Furin、PC5A和PC7可能在ChM-I蛋白剪切加工成熟过程中发挥重要作用。

TNF-α对人软骨细胞中ChM-Ⅰ表达的影响

目的研究肿瘤坏死因子-α(tumor neerosis factor alpha,TNF-α)对人软骨细胞中软骨调节素-Ⅰ(chondro-modulin-Ⅰ,ChM-Ⅰ)表达的影响。方法用浓度为5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL的TNF-α处理细胞24h、48h和72h,荧光实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(western blot)方法检测细胞中ChM-Ⅰ在mRNA和蛋白水平的表达量。结果 TNF-α处理后,各浓度组在各时间点均可下调ChM-Ⅰ的表达(P<0.05),且随浓度和时间的增加,下调作用增强,以20ng/mL处理72h时下调作用最强,下调37%;western blot结果与RT-qPCR相一致。结论肿瘤坏死因子-α可下调人软骨细胞中ChM-Ⅰ的表达。

重组血管抑制剂CHM-I对骨肉瘤的治疗作用

目的:观察重组人软骨调节素(chondromodulin,CHM)蛋白对骨肿瘤的治疗作用。方法:利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出CHM-I基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中诱导表达和纯化重组人软骨调节素蛋白,将重组蛋白与人脐静脉上皮细胞或MG-63骨肉瘤细胞共培养,观察其对内皮细胞形成管样结构和MG-63骨肉瘤细胞生长的影响;将重组蛋白局部注射裸鼠皮下肿瘤,观察其对肿瘤形成的影响。结果:获得纯化的重组人软骨调节素蛋白,该蛋白在体外可以抑制血管内皮细胞管样结构的形成而对肿瘤细胞的生长无影响;重组蛋白瘤内注射可以抑制肿瘤在裸鼠体内的生长。结论:重组人软骨调节素蛋白通过抑制血管形成而抑制肿瘤生长,具有良好的临床应用价值。

软骨调节素Ⅰ的研究进展

软骨调节素Ⅰ(ChM-Ⅰ)是软骨调节素家族中效应最强的一种软骨特异性生长因子,早期对ChM-Ⅰ的研究主要集中在软骨组织,之后研究显示在其他的无血管组织,如眼、心脏瓣膜、椎间盘中也存在ChM-Ⅰ的表达。由于ChM-Ⅰ具有抑制血管生长的特性,很多以血管异常生长为主要表现的疾病会出现ChM-Ⅰ的表达变化,提示其参与了众多疾病的发生和发展过程。在体外环境下,ChM-Ⅰ可抑制血管内皮细胞DNA合成和管状结构的形成,提示ChM-Ⅰ作为一种血管生长抑制因子以及软骨细胞生长刺激因子,参与了软骨的生长、发育以及成熟、老化的过程。

人软骨调节素基因的克隆与纯化

目的克隆人软骨调节素I(CHM-I)cDNA,并在原核表达系统中表达和纯化。方法利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出CHM-I基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG进行诱导表达;对在N末端融合了6×His纯化标签的表达产物进行Westernblot分析和用Ni2+2NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析。结果获得了人软骨调节素cDNA,并成功构建了高效原核表达质粒pET(CHM-I),能有效表达CHM-I蛋白,且CHM-I蛋白的纯度高于90%。结论原核表达系统可有效克隆较高纯度的CHM-I基因。

软骨调节素在成人退变椎间盘中的表达

目的利用分子生物学及免疫组化方法研究软骨调节素（ChM—I）在成人退变椎间盘细胞及椎间盘组织中的表达情况。方法2009年3月至4月取3例因腰椎间盘退变性疾病而需行后路椎间融合患者的椎间盘组织分别进行髓核及纤维环细胞培养。取部分原代细胞利用RT—PCR和Westernblot研究ChM—ImRNA和蛋白在成人退变椎间盘细胞中的表达情况。利用real—timePCR和Westernblot研究不同浓度碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对髓核细胞和纤维环细胞ChM—ImRNA和蛋白表达的影响。收集2008年10月至2009年10月因腰椎间盘退变性疾病而行手术切除的椎间盘组织标本26例，根据MRI表现退变程度为Ⅲ～V级，作为退变组。收集同期因脊柱肿瘤行手术治疗时切除的椎间盘标本6例，退变程度I级，作为对照组。利用免疫组化方法研究ChM—I在不同退变程度椎间盘组织中的表达情况。结果RT—PCR、Westernblot显示ChM—I在椎间盘髓核细胞及纤维环细胞中均有表达。bFGF可抑制ChM．I在髓核及纤维环细胞中的表达，且呈剂量依赖性（P〈0．05）。ChM-I在对照组椎间盘组织中表达量很低，阳性细胞率为0．12±0．03，而在椎间盘发生退变后其表达量明显升高，退变组与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论髓核细胞及纤维环细胞可表达ChM-I，bFGF可明显抑制ChM—ImRNA及蛋白的表达。椎间盘发生退变后ChM—I表达明显升高，提示其可能在椎间盘退变的病理过程中发挥一定的作用。