西加毒素细胞毒性检测方法的建立

小鼠神经母细胞瘤细胞经体外培养后,加入不同剂量的太平洋西加毒素(Pacific ciguatoxin-1,P-CTX-1)、箭毒苷和藜芦定,在不同时间点终止培养,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)标定活细胞量,分析西加毒素剂量与细胞活性之间的线性关系。结果发现,细胞与毒素作用不同时间,西加毒素剂量(x)与光密度值(y)之间的线性关系呈现差异。在10 h、15 h及20 h等不同时间,其线性方程分别为y=-0.082 6x+0.923 0(R2=0.978 9)、y=-0.044 3x+0.601 5(R2=0.962 1)、y=-0.020 4x+0.323 7(R2=0.928 1)。以10 h的检测效率最高及检测结果最准确,因此将其定为最佳检测时间。细胞病变观察也证实了以上结果。

高效液相色谱质-谱联用法测定西加鱼毒素P-CTX-1

建立了对西加鱼毒素中主要成分P-CTX-1的高效液相色谱质谱联用检测方法。色谱条件为色谱柱C18(2.1mm×50mm,1.7μm),柱温40℃。以0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈溶液作为流动相,梯度洗脱(0～3.0min50%A→5%A,3.0～4.5min5%A→50%A),流速为0.6mL/min。质谱条件为电喷雾正离子模式,[M+NH4]+作为前体离子进行多级反应监测,以质荷比(m/z)为1058和1076的子离子分别作为P-CTX-1的定性和定量离子,源温度105℃,喷雾温度350℃,提取电压4.0V,锥气流速49mL/min,喷雾气流速750L/h。在此检测条件下西加鱼毒素P-CTX-1的检出限达0.175μg/L,平均加标回收率为66.0±2.0%,相对标准偏差为6.0%。利用该方法检测了6份采自西太平洋珊瑚礁的鱼类样品,在其中5份样品中检测出P-CTX-1。

西加毒素小鼠生物学检测法的建立

旨在建立西加毒素小鼠生物学检测法。采用19 g^21 g的昆明系雄性小鼠,将一系列不同浓度的西加毒素(P-CTX-1)标准溶液通过腹腔注入小鼠体内,观察其中毒症状,确定1个鼠单位(mu)所代表的毒素剂量,并且建立剂量-中间死亡时间曲线。结果表明对我国昆明系雄性小鼠腹腔注射西加毒素,1个鼠单位所对应的P-CTX-1剂量值约为9.10 ng,其95%可信限为8.67 ng^9.56 ng;剂量-中间死亡时间曲线方程为y=244.9x-1.3937;其中y代表致死时间,x表剂量;将死亡时间t变为时间倒数1/t,对CTX的毒性mu取对数即logmu,得直线回归方程y=1.2076 x-0.047,R2=0.9921,其中y代表西加毒素毒性的对数(logmu),x代表小鼠死亡时间倒数(1/t),R为相关系数。同时利用该方法在0.1、0.2、0.3 ppb 3个浓度水平进行验证试验,结果表明,方法的总体平均回收率为46.58%~50.23%,相对标准偏差范围为1.17%~2.28%。