海岛棉CAD和CAD-Like基因家族的鉴定、表达及其对大丽轮枝菌的响应

【目的】肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素合成途径中的关键酶,在增强植物机械强度、抵御病原菌入侵等方面发挥重要作用。鉴定海岛棉GbCAD、GbCAD-LIKE(GbCADL)基因家族成员,并对其表达特征及其在黄萎病抗性中的作用进行分析,为棉花抗黄萎病机制的解析及抗病育种提供参考。【方法】利用生物信息学方法对海岛棉GbCAD、GbCADL基因家族成员进行鉴定,并对其染色体定位、系统发育关系、基因结构、启动子顺式元件的预测进行系统分析。通过获得公开释放的转录组数据和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析GbCAD基因及GbCADL基因的表达特征。利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术对GbCAD基因及GbCADL基因进行功能分析。【结果】从海岛棉中鉴定到25个GbCAD基因(分布在10条染色体)和34个GbCADL基因(分布在17条染色体)。GbCAD基因分为3个亚组,GbCADL基因分为4个亚组,同一个组内基因含有相似的外显子-内含子结构和保守结构域。GbCAD基因和GbCADL基因具有不同的转录表达特征,其启动子中含有多种激素和胁迫响应元件。转录组数据和qRT-PCR显示,GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL5A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D的表达受大丽轮枝菌诱导,尤其是GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D的表达在大丽轮枝菌处理后显著增加。利用VIGS技术,将显著受大丽轮枝菌诱导表达的GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D分别在棉花中沉默,分析VIGS株系对大丽轮枝菌抗性的变化。结果显示,与对照植株相比,VIGS株系对大丽轮枝菌的抗性显著降低。二氨基联苯胺(DAB)染色结果显示,在未受到黄萎病侵染时,VIGS植株和对照植株的染色程度无显著差异;在大丽轮枝菌处理6 h后,与对照植株相比,沉默株系GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D均表现出较深的着色,表明在沉默株系中有较高的活性氧累积。茎的切片结果显示,大丽轮枝菌处理后,TRV:GbCAD10A/D、TRV:GbCADL4A/D、TRV:GbCADL6A/D、TRV:GbCADL7A/D沉默株系的茎维管组织表现出明显的深褐色,表明其对大丽轮枝菌的抗性显著降低。【结论】抑制GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D的表达可以显著降低棉花对大丽轮枝菌的抗性。

微紫青霉(Penicillium janthinellum)Snef1650诱导大豆胞囊线虫防治效果及GmCAD应答响应

大豆胞囊线虫严重影响大豆的产量和品质,利用生防菌可以有效控制大豆胞囊线虫(SCN)种群数量并降低危害。微紫青霉(Penicillium janthinellum)Snef1650是本实验室筛选出的对大豆胞囊线虫具有较高防效的生防真菌。为了研究Snef1650诱导大豆抗SCN的生防机制,通过触杀、室内盆栽和裂根试验检测Snef1650菌株诱导SCN防治效果;通过实时荧光定量PCR技术检测了木质素合成关键酶肉桂醇脱氢酶(CAD)在线虫胁迫下的表达变化。结果表明,随着Snef1650浓度(20%、40%、60%、80%和100%)和暴露时间(12、24、36和48 h)的增加,J2死亡率逐渐增加。盆栽和裂根试验发现,Snef1650发酵液有效延缓线虫幼虫的侵染和发育。qPCR分析感病品种Williams 82和抗线虫品种小粒黑豆中GmCAD的表达情况发现,GmCAD1和GmCAD2在Snef1650诱导感病品种抗线虫过程中9 dpi和15 dpi时表达显著上调,同时与抗病品种中的表达情况存在时间一致性。间苯三酚木质素染色表明,Snef1650诱导了木质素参与SCN胁迫,与小粒黑豆中染色结果相似,染色部分更加明显。研究结果表明,SCN胁迫下Snef1650可诱导木质素生物合成来抵御线虫的入侵以及发育。

小立碗藓PpCAD4基因敲除载体的构建及功能研究

木质素是植物抵御外界环境的重要成分,肉桂醇脱氢酶(cinnamic alcohol dehydrogenase,CAD)是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一。前期数据表明,在灰霉菌侵染下,PpCAD4基因上调表达,但PpCAD4功能尚未明确。本次研究利用同源重组原理构建PpCAD4.1-PTN182-PpCAD4.2敲除载体,从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain(ADH_N)和zinc-binding dehydrogenase(ADH_zinc_N)结构域。利用PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选并鉴定得到敲除PpCAD4突变体植株。qRT-PCR表明,敲除型植株中PpCAD4的表达量相对野生型减少了84%。通过对配子体的形态观察发现,PpCAD4突变株通过增加配子体中拟叶的数量,使得植株生物量增加,这表明CAD4在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用。用灰霉菌侵染小立碗藓发现,0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15%,cad4-ko菌丝入侵率为40%。侵染1 d后,Ppcad4-ko配子体菌丝侵入率是野生型的2倍。表明PpCAD4能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性。

沉默CCR和CAD基因培育低木质素含量转基因多年生黑麦草

木质素作为维管植物的重要成分之一,主要存在于细胞的次生壁中。然而,木质素却是许多工农业加工过程的限制因素,例如在化学制浆、牧草消化以及木质纤维转化为生物酒精等过程中。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)是催化木质素单体生物合成最后两步的关键酶。本研究根据NCBI中黑麦草CCR和CAD基因序列设计特异引物并添加相应酶切位点,从野生型多年生黑麦草cDNA分离克隆CCR和CAD基因片段,分别构建了含正反方向目的片段的植物表达干扰载体p23-iCCR和p23-iCAD。通过根癌农杆菌EHA105介导转入多年生黑麦草胚性愈伤组织,经过巴龙霉素筛选和PCR检测获得导入了干扰CCR和CAD基因片段的转基因株系i-CCR和i-CAD。常规方法测定相对木质素含量,结果显示,与对照相比,有9株i-CCR植株和11株i-CAD植株木质素含量显著降低,分别平均降低了34.67%,33.86%,且生长正常。本研究表明通过干扰CCR和CAD基因表达,可以获得低木质素含量的多年生黑麦草,为进一步培育易消化吸收的黑麦草提供了良好的种质资源。

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD6的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建

肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,将肉桂醛还原生成相应的肉桂醇。采用PCR方法从棉花中克隆了GhCAD6基因1569 bp的基因组序列,序列分析表明GhCAD6基因由5个外显子和4个内含子组成。为了研究GhCAD6基因的功能,构建由棉纤维组织特异性启动子E6驱动的GhCAD6基因正义、反义表达载体;同时克隆了GhCAD6基因的一段417 bp高度保守的NBD区序列,构建了GhCAD6基因的RNAi干扰载体,并将上述载体转入农杆菌菌株LBA4404中。为通过转基因技术深入研究GhCAD6基因在棉纤维发育和木质素代谢途径中的作用创造条件。

丹参肉桂醇脱氢酶基因(SmCAD)的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)依赖于NADPH还原肉桂醛及其衍生物,是催化木质素单体生物合成途径的最后一步关键酶。通过分析丹参转录组数据库,从丹参中获得一条肉桂醇脱氢酶基因,命名为SmCAD(Genebank注册号:HQ162287)。该序列包含一个长为1083 bp的开放阅读框,有3个内含子和4个外显子,编码360个氨基酸,含有NADP(H)结合域,Zn1和Zn2锌结合位点。利用BD walking的方法获得其启动子序列1202 bp,序列分析结果表明,SmCAD启动子区包含茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)响应元件以及MYB结合位点。利用实时荧光定量PCR分析表明,该基因在丹参根、茎、叶中均有表达,且其表达受到MeJA的诱导和GA3的抑制,推测该基因可能参与了丹参对外源信号的应答反应。研究结果可为进一步研究SmCAD基因在丹参中的具体功能提供理论依据。

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。本研究从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD3(GenBank登录号为FJ376601)。GhCAD3全长1573 bp,具有1个1080 bp的开放阅读框,5′非编码区为35 bp,3′非编码区为458 bp,编码359个氨基酸,预测分子量约为39.116kD,等电点为7.48。氨基酸同源性分析发现,GhCAD3与其他CAD一致性为64.13%。为了进一步研究GhCAD3基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-CAD3,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导7 h。

巨龙竹肉桂醇脱氢酶基因(DsCAD)的克隆及功能分析

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)是木质素生物合成途径的关键酶。研究根据巨龙竹转录组数据设计的一对特异引物,运用逆转录PCR(RT-PCR)技术从巨龙竹茎秆中克隆得到肉桂醇脱氢酶基因DsCAD,该基因包含1080 bp的完整c DNA开放阅读框,编码359个氨基酸,理论相对分子质量38689.6,等电点6.18。利用生物信息学方法对DsCAD进行分析,结果显示:DsCAD氨基酸序列包含CAD超家族的保守结构域,具有植物CAD基因的典型特征;其与禾本科植物CAD基因的同源性较高,亲缘关系较近,其中与孝顺竹的同源性高达95%。荧光定量PCR检测结果显示DsCAD基因在巨龙竹竹笋中的表达量要高于茎秆,而在茎秆中的表达量有明显高于叶。

杉木CAD基因生物信息学分析

杉木CAD片段为信息探针,利用序列拼接方法获得了738bp的cDNA序列.利用MEGA4.0软件对不同进化层次的代表植物相应CAD基因进行比对,构建系统进化树.利用生物信息学方法分析了杉木CAD基因的结构与功能,其中包括核苷酸序列的组成、ORF识别、CpG岛、限制性酶切位点分析、卷曲螺旋、亲水性、糖基位点及二级结构.结果表明:杉木与铁杉的CAD基因具有99.00%的同源性;该序列在88～737bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个碱性蛋白,亲水性较强,疏水性较弱,信号肽序列为第1位～第11位,二级结构以α-螺旋(27.50%)与不规则盘绕(41.50%)为主,延伸链(22.50%)也是该蛋白的重要结构元件,β转角区域仅为8.50%.

杨树肉桂醇脱氢酶基因序列和表达模式分析及CAD4酶活性检测

应用生物信息学方法从杨树基因组数据库中筛选出19个杨树肉桂醇脱氢酶基因,它们聚为3类。序列分析表明,杨树CAD基因家族主要通过全基因组加倍和串联复制的方式进行扩张。杨树和拟南芥CAD家族共6对旁系同源基因,在较强的净化选择压力下进化。19个基因在杨树不同组织中均有表达,表达量较高的是PoptrCAD17、PoptrCAD4、PoptrCAD10和PoptrCAD7,其他基因表达相对较少,相同亚类的CAD基因表达变化趋势接近。从毛白杨中克隆得到PoptrCAD4,体外表达的CAD4酶催化活性很强,具有明显的松柏醇底物偏好。

苦荞FtCAD-1和FtCAD-2基因克隆及组织表达分析

【目的】克隆苦荞肉桂醇脱氢酶(CAD)基因并分析其组织表达特性,为深入研究CAD基因在苦荞果壳形成中的分子调控机制提供理论依据。【方法】基于苦荞转录组测序结果,从苦荞厚果壳品种云荞1号和薄果壳品种小米荞克隆CAD基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CAD基因在不同果壳厚度类型(厚果壳苦荞和薄果壳苦荞)不同组织的表达情况。【结果】从薄果壳苦荞和厚果壳苦荞中均克隆获得2条苦荞CAD基因,且这2条基因序列在薄果壳苦荞与厚果壳苦荞中均完全一致,命名为FtCAD-1和FtCAD-2。FtCAD-1基因的开放阅读框(ORF)长度为876 bp,编码291个氨基酸残基,为疏水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞核和细胞质;FtCAD-2基因的ORF长度为1083 bp,编码360个氨基酸残基,为亲水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞质。FtCAD-1和FtCAD-2蛋白均具有CAD蛋白3个典型的保守结构域,且不具有跨膜结构域和信号肽,属于非分泌蛋白。FtCAD-1与数据库目标蛋白2cf5.1.B的结构相似度为74.74%,而FtCAD-2与数据库目标蛋白5z0c.1.A的结构相似度为63.03%。FtCAD-1与拟南芥的第一类CAD蛋白(AtCAD4和AtCAD5)的亲缘关系较近;FtCAD-2与拟南芥的第二类CAD蛋白(AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6等)的亲缘关系较近。FtCAD-1和FtCAD-2基因均在种仁中的相对表达量最高,且厚果壳苦荞与薄果壳苦荞间无显著差异(P>0.05)。FtCAD-1基因在厚果壳苦荞叶、花和果壳中的相对表达量显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01)高于薄果壳苦荞,尤其是在厚果壳苦荞果壳中相对表达量是薄果壳苦荞的16倍。FtCAD-2基因除了在薄果壳苦荞果壳中相对表达量显著高于厚果壳苦荞外,在其他组织中的相对表达量均表现为厚果壳苦荞高于薄果壳苦荞。【结论】FtCAD-1属于第一类CAD基因,具有明显的组织表达特异性,推测其在苦荞木质素生物合成过程中发挥重要调控作用。

‘三红蜜柚’CmCAD基因的克隆与表达分析

为了探究CmCAD基因在‘三红蜜柚’果实发育过程中的作用与表达规律,该研究以‘三红蜜柚’果实为材料,利用反转录PCR技术克隆获得3个‘三红蜜柚’CmCAD基因,分别命名为CmCAD1、CmCAD3和CmCAD4。对这3个基因所编码的蛋白进行了生物信息学分析,研究了它们在不同品种蜜柚及‘三红蜜柚’果实生长发育阶段的表达模式。结果表明:克隆得到的3个CmCAD基因cDNA长度分别为1 032 bp、1 080 bp和1 071 bp,编码344、360和357个氨基酸;生物信息分析发现3个CmCAD基因编码的蛋白含有相同的保守结构域,均有跨膜螺旋结构与磷酸化位点;系统进化树分析表明,CmCAD1、CmCAD3和CmCAD4分别与甜橙CsCAD1、拟南芥AtCAD9和甜橙CsCAD4的亲缘关系最近。实时定量PCR分析结果显示,3个CmCAD基因在不同品种蜜柚果实生长过程中表达水平存在差异,且3个CmCAD基因在‘三红蜜柚’果实发育过程中的表达规律也有所不同。研究推测,CmCAD4具有一定的潜在功能,可能参与调控‘三红蜜柚’果实中木质素的合成,但基因的具体功能与调控机理还需进一步探索。

洋草麦HdCAD基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆洋草麦肉桂醇脱氢酶基因(HdCAD),揭示HdCAD基因的序列特性,对HdCAD蛋白进行生物信息学分析。[方法]以洋草麦转录组数据中的HdCAD为参考序列,设计1对特异引物,利用RT-PCR技术克隆HdCAD基因;利用生物信息学软件对HdCAD基因序列进行分析,对HdCAD蛋白的理化性质、蛋白结构、亚细胞定位等进行预测和系统进化树分析。[结果]HdCAD基因编码区全长1071 bp,共编码356个氨基酸。HdCAD蛋白含有17个磷酸化位点,不含有跨膜结构域和信号肽位点,预测定位在细胞质中;二级结构中,以无规卷曲元件占比最高;含有1个典型的CAD1结构域,属于MDR超家族。系统进化树分析结果显示,HdCAD蛋白与二粒小麦、节节麦、西藏裸大麦亲缘关系最近。[结论]该试验成功克隆HdCAD基因、预测了该基因编码蛋白的序列特征和功能,可以为今后研究洋草麦抗非生物胁迫功能提供参考。

小麦肉桂醇脱氢酶基因(TaCAD1)全长cDNA序列及生物信息学分析

小麦(Triticum aestivum)是世界三大主粮之一,倒伏严重制约了小麦产量的提高。小麦肉桂醇脱氢酶基因(TaCAD1)是小麦木质素合成的关键基因,小麦体内木质素含量越高,茎秆强度越高,抗倒伏能力随之增强。为了探明小麦肉桂醇脱氢酶基因的生物学功能,对TaCAD1基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明:TaCAD1基因cDNA序列全长1311bp,包含1个长度为1083bp的开放阅读框(ORF),编码360个氨基酸。TaCAD1蛋白等电点(pI)为5.74,分子量为38625.45 Da,其不稳定系数为23.91,属于稳定蛋白质。推导的TaCAD1蛋白为疏水性蛋白,不存在跨膜区,可能位于细胞质内,该蛋白的二级结构元件主要为无规卷曲。TaCAD1蛋白在进化过程中较为保守,与节节麦、大麦、高羊茅、黑麦草、短花药野生稻CAD蛋白的一致性达94.81%。研究结果为进一步探究TaCAD1在小麦抗倒伏过程中的作用及小麦抗倒伏的分子育种提供参考。

植物肉桂醇脱氢酶及其基因研究进展

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)作为植物次生代谢特别是木质素合成的关键酶,与植物生长发育和抵御病原菌入侵关系密切,研究CAD基因表达调控及其与组织木质化的关系具有重要的植物生理学意义.该文综述了植物CAD的蛋白特征、酶学性质、基因分布和分类、基因结构和表达调控以及CAD表达与木质素合成的关系,为研究CAD在植物生长发育和抗病中的作用提供理论指导.

苯并噻二唑诱发水稻对稻瘟病抗性中防卫相关酶活性的变化

分析了苯并噻二唑 (BTH)诱导水稻对稻瘟病抗性中苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、肉桂醇脱氢酶 (CAD)、过氧化物酶(POD)、脂氧合酶 (L OX)、β- 1,3-葡聚糖酶和几丁酶等活性的变化。结果表明 BTH诱导处理亲和性水稻品种第 3叶后提高了处理叶及其上位第 4叶中 CAD、L OX和β- 1,3-葡聚糖酶等的活性 ;经 BTH处理的幼苗接种稻瘟菌后 ,处理叶和其上位叶中CAD、POD、L OX和 β- 1,3-葡聚糖酶等活性快速增加 ,且增长幅度均显著大于对照。几丁酶活性在受稻瘟菌侵染后升高 ,但BTH诱导处理并不能促进其增加 ;PAL活性在 BTH处理及稻瘟菌接种后均无明显变化。这些结果说明 ,BTH处理能诱导CAD、POD、L OX和β- 1,3-葡聚糖酶等活性的增加 ,而且这些酶活性的升高可能与

棉花肉桂醇脱氢酶基因的克隆与分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的肉桂醇脱氢酶基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD5(GenBank登录号为FJ848868)。研究结果表明:GhCAD5全长1488bp,具有一个1068bp的开放阅读框,5′非编码区为140bp,3′非编码区为280bp,编码355个氨基酸,预测分子量约为38.403kDa,等电点为7.67。氨基酸同源性分析发现,GhCAD5与拟南芥AtCAD1和水稻OsCAD4的同源性较高。利用PCR方法克隆了GhCAD5基因的基因组序列,长度为1695bp,包含6个外显子和5个内含子。将GhCAD5的ORF连接于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导,获得了相应蛋白的表达。棉花GhCAD5基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。

杜仲肉桂醇脱氢酶基因克隆及序列分析

以杜仲一叶一心期幼叶为材料 ,提取总RNA ,采用RT -PCR技术分离得到 4 98bp核苷酸片段 ,此核苷酸片段与GenBank中的苹果树肉桂醇脱氢酶 (CAD)基因序列有 6 4 .1%的同源性 ,与桉树mRNACAD有 6 3.9%的同源性。所克隆的cDNA编码 16 5个氨基酸残基 ,其序列与苹果树CAD相应片段有 6 8.5 %的同源性 ,与桉树mRNACAD相应片段有 6 6 .1%的同源性。推测克隆的核苷酸片段为杜仲CAD的基因片段。

木质素合成关键酶——肉桂醇脱氢酶的研究进展

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素合成途径的关键酶之一,它作用于木质素单体生物合成的最后一步。重点综述了肉桂醇脱氢酶(CAD)的在基因家族方面,基因调控方面以及蛋白结晶方面的研究进展,讨论了存在的问题并提出了相关策略。

梨果实中肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶。本研究分别提取了"砀山酥梨"及"幸水"梨果肉总RNA,并通过RT-PCR、克隆和测序,成功获得了2个CAD的大小为689bp的cDNA片段,并分别命名为PB-CAD(登录号:FJ478151)和PP-CAD(登录号:FJ478152)。在核苷酸水平上,这两个基因片段只有4个碱基的差异,编码相似性达99.6%的两个氨基酸序列,该序列由229个残基组成。通过蛋白质序列比较,发现梨果实CAD与许多植物中CAD氨基酸序列极为相似,与苹果Malus domestica(AAC06319)、梅Prunus mume(BAE48658)、枇杷Eriobotryajaponica(ABV44810)和葡萄Vitis vinifera(CAO21890)的相似性分别达到97.8%、95%、92.6%和83.4%。