Circ-0007766作为miR-1972海绵调控HER2表达促进乳腺癌细胞迁移和侵袭

背景与目的:人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)是乳腺癌最重要的转移驱动因子之一,20%~30%的乳腺癌患者为HER2高表达型。HER2的表达水平可以在多个分子层面受到调控并且决定了乳腺癌细胞的转移潜能,但HER2的表达如何在mRNA水平受到调控仍不清楚。Circ-0007766是源自HER2的编码基因酪氨酸激酶受体2(tyrosine kinase receptor 2,ERBB2)形成的circRNA,circ-0007766能否通过内源竞争RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)机制调控HER2表达仍鲜见报道。本研究旨在探讨Circ-0007766作为miR-1972海绵调控HER2表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。方法:本研究使用高通量circRNA芯片筛选出在HER2阳性乳腺癌细胞中表达特异性高表达的circRNA;采用荧光原位杂交实验(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测circ-0007766的亚细胞定位;采用microRNA检测原位杂交(BaseScope)实验分析circ-0007766在乳腺癌组织中的表达水平及其临床诊断意义;通过体外转染克隆质粒和siRNA构建过表达和敲低circ-0007766的乳腺癌细胞模型;采用transwell实验评估circ-0007766对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响,测定MDA-MB-231与SK-BR-3细胞的迁移和侵袭能力,并用transwell实验评估circ-0007766能否通过miR-1972促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。利用双荧光素酶报告基因检测验证circ-0007766能否通过结合miR-1972调控HER2的表达。通过RNA反义纯化(RNA antisense purification,RAP)实验进一步验证circ-0007766和miR-1972是否具有直接相互作用;在MDA-MB-231细胞中进行RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)检测,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)测定HER2 mRNA的相对3'UTR。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白表达情况。结果:circ-0007766在HER2阳性乳腺癌细胞中高表达,circ-0007766分布于细胞质和细胞核,并且主要分布于细胞质。Circ-0007766在乳腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,在HER2阳性乳腺癌中表达显著升高,且在HER2阳性乳腺癌样本中的表达水平显著高于HER2阴性样本。在HER2阴性乳腺癌细胞中过表达(在HER2阳性乳腺癌细胞中敲低)circ-0007766能够促进(抑制)乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。Circ-0007766与抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的miR-1972直接结合,形成ceRNA调控网络,抑制由miR-1972介导的HER2 mRNA和蛋白表达水平下调。Circ-0007766能够上调由miR-1972负调控HER2介导的乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。CircRNA通过封存miRNA发挥ceRNA的功能,从而在转录和翻译水平上调控基因表达。最后,我们发现circ-0007766和HER2在乳腺癌细胞和组织样本中的表达呈正相关,而miR-1972和HER2的表达水平呈负相关。Circ-0007766能特异性靶向miR-1972,从而阻碍miR-1972对HER2表达的调控作用。结论:本研究发现circ-0007766通过miR-1972/HER2信号轴促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭,为转移性HER2阳性乳腺癌患者提供了一个新的生物标志物和潜在治疗靶点。

妊娠期高血压患者血清circ-0002348和circ-0002814表达水平及其与妊娠结局相关性研究

目的:探讨妊娠期高血压患者血清circ-0002348和circ-0002814表达水平及其与妊娠结局的相关性。方法:选取妊娠期高血压患者90例为观察组,另选取同期健康孕妇79名为对照组。根据妊娠结局将患者分为妊娠结局不良组(18例)和妊娠结局良好组(72例)。采用RT-qPCR检测血清circ-0002348和circ-0002814表达水平。分析妊娠期高血压患者不良妊娠结局的影响因素。分析血清circ-0002348和circ-0002814对妊娠期高血压患者不良妊娠结局的预测价值。结果:观察组不良孕育史比例高于对照组(P<0.05)。与对照组比较,观察组血清circ-0002348表达水平升高,血清circ-0002814表达水平降低(均P<0.05)。与妊娠结局良好组比较,妊娠结局不良组患者不良孕育史比例更高,血清circ-0002348表达水平升高,血清circ-0002348表达水平降低(均P<0.05)。血清circ-000243和circ-0002814是妊娠期高血压患者不良妊娠结局的影响因素(均P<0.05)。血清circ-0002348和circ-0002814联合预测的曲线下面积(AUC)大于两者分别单独预测的AUC(均P<0.05)。结论:妊娠期高血压患者血清circ-000234高表达,血清circ-0002814低表达,与妊娠结局有关,两者联合对患者不良妊娠结局预测价值较高。

外泌体circ-0001328靶向miR-545-3p对胆囊癌细胞吉西他滨耐药的影响

目的:明确circ-0001328、miR-545-3p对胆囊癌细胞吉西他滨(gemcitabine,GEM)耐药的影响并探究相关机制。方法:从胆囊癌细胞(NOZ、GBC-SD和SGC-996)和对GEM耐药的胆囊癌细胞(NOZ/G、GBC-SD/G和SGC-996/G)中提取外泌体,采用qRT-PCR检测circ-0001328、miR-545-3p表达水平。将NOZ/G细胞分别转染sh-NC载体(sh-NC组)、sh-circ-0001328载体(sh-circ-0001328组)、inhibitor-NC(inhibitor-NC组)、miR-545-3p inhibitor(miR-545-3p inhibitor组)、sh-circ-0001328+miR-545-3p inhibitor(sh-circ-0001328+miR-545-3p inhibitor组),采用CCK-8法检测GEM半抑制浓度(semi-inhibitory concentration,IC 50)和光密度(optical density,OD)值,EdU染色检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测增殖相关蛋白(Cyclin E1、CDK2)和凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bax)表达水平,相关试剂盒检测谷氨酰胺代谢,包括谷氨酰胺(glutamine,Gln)摄取量、谷氨酸(glutamate,Glu)和α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)产生量。采用生信分析、荧光素酶报告基因及RIP试验验证circ-0001328、miR-545-3p之间调控关系。结果:与胆囊癌细胞相比,对GEM耐药的胆囊癌细胞外泌体中circ-0001328表达上调、miR-545-3p表达下调,其中NOZ/G细胞最为显著(P<0.05)。与sh-NC组比较,sh-circ-0001328组IC 50、24、48、72 h OD值降低,EdU阳性率、Cyclin E1、CDK2蛋白表达降低,凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达升高,Gln摄取量、Glu和α-KG产生量减少(P<0.05)。与inhibitor-NC组比较,miR-545-3p inhibitor组IC 50、24、48、72 h OD值升高,EdU阳性率、Cyclin E1、CDK2蛋白表达升高,凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达降低,Gln摄取量、Glu和α-KG产生量增加(P<0.05)。与sh-circ-0001328组比较,sh-circ-0001328+miR-545-3p inhibitor组IC 50、24、48、72 h OD值升高,EdU阳性率、Cyclin E1、CDK2蛋白表达升高,凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达降低,Gln摄取量、Glu和α-KG产生量增加(P<0.05)。miR-545-3p是circ-0001328靶基因,circ-0001328直接抑制miR-545-3p表达。结论:对GEM耐药的胆囊癌细胞外泌体中circ-0001328表达上调、miR-545-3p表达下调,circ-0001328靶向miR-545-3p增强胆囊癌细胞对GEM耐药,机制可能与促进谷氨酰胺代谢有关。

circ-104640在Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌组织及血清中的异常高表达及其意义

目的探究circ-104640在Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌患者的肿瘤组织、癌旁组织、血清和肺腺癌细胞系中的表达情况,评估其作为Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌潜在的新的生物标志物和治疗靶点的可能性。方法从GEO数据库中下载微阵列数据集GSE101684并获得Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌差异化表达circRNA的表达谱,挑选特异性高表达的circ-104640作为候选标志物。使用实时荧光定量PCR法检测circ-104640在Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌患者的组织、血清和肺腺癌细胞系中的相对表达量,分析其与临床病理特征的关系。采用ROC曲线评估circ-104640对Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌的诊断价值。结果基于GEO数据库的分析结果和Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌患者的组织样本及血液样本,发现与癌旁组织、健康人血清和肺上皮细胞系相比,circ-104640在Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌组织、血清和肺腺癌细胞系中表达增加。此外,circ-104640的结构具有稳定性且对RNase-R的消化具有一定程度的抗性。ROC结果显示,在肺腺癌组织和血清中circ-104640诊断肺腺癌的AUC分别为0.829(95%CI:0.758~0.901,P<0.001)和0.874(95%CI:0.809~0.939,P<0.0001)。结论circ-104640在肺腺癌组织、血清和细胞系中呈高表达,并且与肺腺癌的发生发展有着密切的联系。circ-104640的环状结构使其能够稳定存在并对RNase-R的消化具有抗性。circ-104640可能是Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌潜在的新的生物标志物和治疗靶点,且对临床Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌有一定的早期诊断价值。

circ-0030042通过miR-145/PTEN轴调控对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及迁移的影响

目的:探讨circ-0030042与人第10号染色体缺失的磷酸酶(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的相互作用关系,并分析其在增生性瘢痕(Hypertrophic scar,HS)患者中对成纤维细胞增殖与迁移的影响及作用机制。方法:通过circRNA序列和定量聚合酶链反应(PCR技术)检测正常皮肤成纤维细胞(NSFBs)和增生性瘢痕患者成纤维细胞(HSFBs)中circ-0030042的表达。用CCK8检测法检测转染48 h后的HSFBs细胞增殖情况。利用stubRFP-sensGFP-LC3基因转染、流式细胞仪及电子显微镜观察circ-0030042对miR-145/PTEN轴调控VEGF水平的表达。利用生物信息学分析、RNA免疫沉淀、免疫荧光检测等方法,揭示circ-0030042介导HS患者成纤维细胞增殖与迁移的作用机制。结果:circ-0030042在增生性瘢痕中显著上调,过表达时作为VEGF海绵抑制miR-145诱导的成纤维细胞,维持体内稳定性。此外,circ-0030042通过海绵化VEGF水平并阻断其miR-145捕获转录因子(FOXO1)mRNA来影响自噬,而circ-0030042诱导FOXO1的抑制被VEGF水平过表达或circ-0030042结合减少所抵消。过表达circ-0030042对成纤维细胞的增殖抑制与VEGF表达的抑制作用被过表达miR-145部分抵消。结论:干扰circ-0030042通过靶向下调miR-145/PTEN轴进而抑制HSFBs细胞的增殖与迁移,进一步诱导恶性细胞凋亡。

环状RNA分子circ＿0007766通过上调细胞周期相关蛋白Cyclin D1/CyclinE1/CDK4的表达促进肺腺癌细胞增殖

背景与目的环状RNA(circular RNA, circRNA)是有别于传统线性RNA的一类新型非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA),越来越多的研究提示circRNA可作为诸多恶性肿瘤的生物学标志物,并成为治疗的潜在靶标。因此从circRNA角度挖掘肺腺癌新型分子靶标,将有助于揭示肺腺癌发生发展新机制,并为临床诊疗提供新思路。本研究针对前期筛选出的一个肺腺癌组织高表达circRNA即circ_0007766进行体外生物学功能验证和分析,从而对circ_0007766促进肺腺癌增殖的相关机制进行初步探索。方法首先通过qPCR检测考察肺腺癌细胞中circ_0007766的表达水平,然后采用siRNA干扰circ_0007766的表达,通过CCK8法、划痕修复、PI单染和AnnexinV/PI双染方法检测circ_0007766沉默表达对肺腺癌细胞的增殖、周期和凋亡作用的影响。此外,我们还采用qPCR和western blots方法初步研究了circ_0007766在肺腺癌细胞中的生物学作用机制。结果 qPCR检测表明肺腺癌细胞株中表达有circ_0007766,在SPCA-1细胞中干扰circ_0007766表达,发现细胞增殖和迁移能力受到了抑制,细胞周期发生了G_0/G_1期阻滞,而细胞凋亡则不受影响。circ_0007766的缺失并不影响其亲本基因ERBB2的mRNA表达,而对eIF4A3调控的细胞周期相关基因Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的mRNA和蛋白水平均有影响。结论本研究通过体外功能学研究,发现circ_0007766可能对肺腺癌细胞增殖、迁移具有促进的作用,进一步的分子机制研究发现circ_0007766可上调细胞周期关键蛋白Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的表达,进而促进肺腺癌恶性增殖。本研究以circRNA为视角,将对肺腺癌发生发展机理及预后判断提供新线索,为临床治疗应用提供新靶标。

环状RNA circ-0014359在胶质瘤组织中的表达及意义

目的探讨环状RNA circ-0014359(简称circ-0014359)在胶质瘤组织中的表达及意义。方法实时定量PCR法检测118例胶质瘤组织和60例正常脑组织circ-0014359的表达水平。以circ-0014359表达量中位数为截断值,分为高表达和低表达。随访结束时间为2019年6月,总生存期(OS)为术后第1天至死亡或最后一次随访,无进展生存期(PFS)为术后至第一次发生疾病进展或任何原因死亡的时间。结果胶质瘤组织circ-0014359表达水平明显高于正常脑组织(P<0.05)。随胶质瘤病理级别增高,circ-0014359表达水平明显增高(P<0.05)。多因素Cox比例回归风险模型分析结果显示,circ-0014359高表达是胶质瘤病人OS和PFS较短的独立影响因素(P<0.05)。生存曲线分析显示,高表达组OS和PFS[分别为(25.31±8.03)个月和(15.22±3.13)个月]明显低于低表达组[分别为(35.19±7.03)个月和(19.32±2.84)个月;P<0.05]。结论胶质瘤组织circ-0014359呈高表达,并且与不良预后有关。

Circ-0080229结合蛋白的筛选及其在胶质瘤调控中的意义

目的鉴定EGFR基因来源的环状RNA circ-0080229在胶质瘤中所结合的蛋白,并分析其在胶质瘤调控中所发挥的作用。方法通过PCR技术验证circ-0080229在胶质瘤中高表达,再应用RNA结合蛋白纯化实验及蛋白质谱技术,分析circ-0080229所结合的蛋白质。利用TCGA数据库进行circ-0080229结合蛋白的差异表达分析及生存分析,筛选出最有价值的circ-0080229结合蛋白ANXA2,并进行细胞功能实验的验证。结果共有33个蛋白可与circ-0080229结合,其中以ANXA2和SIL1为代表的蛋白与胶质瘤病理分级和预后相关。在胶质瘤U251细胞系中,下调ANXA2的表达可显著抑制细胞的增殖、迁移及侵袭能力。结论环状RNA circ-0080229可特异性结合ANXA2等RNA结合蛋白,同时circ-0080229结合蛋白ANXA2可促进胶质瘤的增殖能力、迁移能力与侵袭能力。

Circ-0033074靶向miR-296-5p对前列腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响

目的探讨Circ-0033074对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及作用机制。方法体外培养前列腺癌细胞DU-145、22Rv1和LNCaP及前列腺上皮细胞RWPE-1,RT-qPCR法检测细胞中Circ-0033074和miR-296-5p表达水平。以前列腺癌细胞DU-145为研究对象,分为si-NC组、si-Circ-0033074组、si-Circ-0033074+anti-miR-NC组和si-Circ-0033074+anti-miR-296-5p组。CCK-8试剂盒、Transwell小室、流式细胞术分别检测细胞增殖、细胞迁移和侵袭及细胞凋亡,Western印迹检测CyclinD1、P21、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、Bax和Bcl-2蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证Circ-0033074和miR-296-5p调控关系。结果前列腺癌细胞系DU-145、22Rv1和LNCaP中Circ-0033074的表达显著高于前列腺上皮细胞RWPE-1(P<0.05),而miR-296-5p的表达显著低于RWPE-1细胞(P<0.05)。与si-NC组比较,si-Circ-0033074组OD值、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2、MMP-9和Bcl-2的蛋白表达显著降低,细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达显著升高(均P<0.05)。Circ-0033074靶向负调控miR-296-5p,沉默miR-296-5p逆转沉默Circ-0033074对DU-145细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。结论沉默Circ-0033074可靶向上调miR-296-5p表达抑制前列腺癌细胞DU-145增殖、迁移和侵袭,并诱导DU-145细胞凋亡。

骨肉瘤组织中环状RNA circ-0002052表达水平及与临床病理特征和预后的相关性分析

目的分析骨肉瘤组织中环状RNA circ-0002052表达水平及与临床病理特征和预后的相关性。方法采用回顾性研究,收集新疆医科大学第一附属医院收治的60例骨肉瘤患者的临床资料,经手术切除肿瘤组织和癌旁正常组织,根据实时荧光定量聚合酶链式反应法对组织标本中环状RNA circ-0002052的表达情况进行检测,分析circ-0002052表达与患者临床病理特征的相关性。随访3年,比较circ-0002052不同表达情况的患者生存时间的差异;采用多因素Cox回归分析影响患者预后情况的危险因素。结果相比癌旁正常组织(1.06±0.09),环状RNA circ-0002052在骨肉瘤组织中的表达量(0.45±0.05)显著下调(P<0.01)。根据骨肉瘤组织环状RNA circ-0002052表达量的均值(0.48),分为高表达组(33例)与低表达组(27例);结果显示,低表达组TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期和远处转移发生率均明显高于高表达组(P<0.01),两组性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径和分化程度的比较,均无显著差异(P>0.05)。低表达组3年总生存率为37.05%(10/27),明显低于高表达组72.73%(24/33)(P<0.05);低表达组3年总生存期为(16.06±1.15)个月,明显短于高表达组(28.07±2.25)个月(P<0.01)。环状RNA circ-0002052低表达是骨肉瘤患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。结论环状RNA circ-0002052在骨肉瘤组织中具有表达降低的特点,并且其低表达与患者预后不良密切相关。

circ-0005273靶向miR-1200对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨circ-0005273对食管癌细胞增殖和凋亡的影响及可能机制。方法收集41例食管癌患者的癌组织及癌旁组织,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测组织中circ-0005273和miR-1200表达。体外培养食管癌Eca109细胞,分别转染circ-0005273小干扰RNA、miR-1200模拟物,或共转染circ-0005273小干扰RNA与miR-1200抑制剂。采用CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白印迹法检测细胞中cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-1200与circ-0005273调控关系。结果食管癌组织中circ-0005273的表达量高于癌旁组织,而miR-1200的表达量低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。干扰circ-0005273表达或过表达miR-1200后,Eca109细胞光密度(OD)值和克隆形成数降低,凋亡率和cleavde-caspase9、cleavde-caspase3蛋白的表达量增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。circ-0005273靶向负调控miR-1200,干扰miR-1200可逆转干扰circ-0005273对Eca109细胞增殖和凋亡的影响。结论circ-0005273在食管癌组织中呈高表达,干扰circ-0005273可能通过靶向负调控miR-1200阻碍了食管癌细胞增殖,并加剧了细胞凋亡。

Circ-0003910在HER2阳性乳腺癌中的表达、定位、生物学作用及蛋白质组学研究

背景与目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,2020年已成为全球新发病例最多的癌症。人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阳性型乳腺癌约占所有乳腺癌病例数的20%,是一种复发转移率高的分子分型。因此,探索HER2阳性型乳腺癌相关生物标志物具有十分重要的意义。本文旨在探讨circ-0003910在HER2阳性型乳腺癌组织和细胞中的表达水平和定位,阐明circ-0003910对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响,探索高表达circ-0003910对乳腺癌细胞蛋白质组学的影响。方法:通过高通量环状RNA(circular RNA,circRNA)芯片筛选在HER2阳性乳腺癌细胞中差异表达的circRNA,选择显著高表达的circRNA作为研究目标;RNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)实验检测circ-0003910的亚细胞定位;采用BaseScope实验分析circ-0003910在乳腺癌组织中表达水平及临床诊断意义;通过体外转染克隆质粒和siRNA构建过表达和敲低circ-0003910的乳腺癌细胞;采用transwell迁移和侵袭实验检测circ-0003910对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响;通过TMT定量蛋白质组学技术,初步探索circ-0003910促进乳腺癌细胞迁移和侵袭的分子机制。结果:CircRNA芯片分析显示,在HER2阳性乳腺癌细胞和正常乳腺细胞中共筛选出1843个差异表达的circRNA(fold change≥2,P<0.05),其中上调的circRNA有845个,下调有998个。与正常乳腺上皮细胞相比,circ-0003910在HER2阳性乳腺癌细胞中的差异表达倍数为24.39。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)实验结果显示,circ-0003910在HER2阳性乳腺癌细胞中表达水平高于其他分子分型乳腺癌细胞;BaseScope实验结果表明,circ-0003910分布于HER2阳性乳腺癌细胞的细胞质和细胞核,但主要定位于细胞质中。过表达circ-0003910促进MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移和侵袭;敲低circ-0003910抑制SK-BR-3乳腺癌细胞的迁移和侵袭。蛋白质组学鉴定结果显示,过表达circ-0003910后,共有197个蛋白表达发生改变,其中104个蛋白质上调,93个蛋白质下调。GO和KEGG富集分析提示,差异表达蛋白质参与细胞黏附分子合成和癌症中转录失调等重要生物学进程。结论:Circ-0003910在HER2阳性乳腺癌细胞中表达上调,能够促进乳腺癌细胞迁移和侵袭,可能是HER2阳性乳腺癌新的生物标志物和抗肿瘤转移治疗靶点。

吉非替尼通过靶向circ-0000745/miR-421轴调控胃癌细胞N87增殖、凋亡的分子机制

目的:探讨吉非替尼是否通过环状RNA(circRNA)circ-0000745/微小RNA-421(miR-421)轴调控胃癌细胞N87增殖、凋亡。方法:运用细胞计数试剂盒8(CCK-8)、平板克隆实验、蛋白印迹(Western blot)分析、流式细胞术与定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)测定空白对照(NC)组、0.125,0.25,0.5μmoL·L^(-1)吉非替尼组、si-NC组、si-circ-0000745组、NC+si-NC组、吉非替尼+si-NC组、吉非替尼+si-circ-0000745组、si-NC+anti-miR-NC组、si-circ-0000745+anti-miR-NC组、si-circ-0000745+anti-miR-421组胃癌细胞N87的活力、克隆形成、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达、凋亡率与circ-0000745、miR-421表达。双荧光素酶实验分析circ-0000745与miR-421间的关系。结果:与NC组相比,0.125,0.25,0.5μmol·L^(-1)吉非替尼组细胞活力、克隆形成数、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量、miR-421表达量逐渐降低,而P21蛋白表达量、凋亡率、Bax蛋白表达量、circ-0000745表达量逐渐增加,且不同剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。circ-0000745靶向负调控miR-421。与si-NC组相比,si-circ-0000745组胃癌细胞N87活力、克隆形成数、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量升高,P21蛋白表达量、凋亡率和Bax蛋白表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与吉非替尼+si-NC组相比,吉非替尼+si-circ-0000745组N87细胞中活力、克隆形成数、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量增加,P21、Bax蛋白表达量、凋亡率减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。与si-circ-0000745+anti-miR-NC组相比,si-circ-0000745+anti-miR-421组N87细胞活力、克隆形成数、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量降低,P21、Bax蛋白表达量、凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:吉非替尼通过上调circ-0000745靶向miR-421,抑制胃癌细胞N87增殖,并诱导其凋亡。

Circ-101555经Wnt信号通路促进甲状腺癌的侵袭和迁移

目的探讨circ-101555经Wnt信号通路促进甲状腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制。方法收集79例甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)组织及癌旁正常甲状腺组织,应用RNA原位杂交技术检测circ-101555表达情况,并分析其与PTC临床病理特征的关系。应用MTT法检测甲状腺癌细胞增殖活性;Transwell小室检测甲状腺癌细胞侵袭和迁移的能力变化;双荧光素酶报告实验验证miR-1178对下游靶基因Wnt1的调控;Western blot法分析circ-101555下游基因蛋白的表达。结果Circ-101555 RNA在PTC组织中主要为阳性,而在癌旁正常甲状腺组织主要为阴性,PTC组织中circ-101555的阳性比值为0.758±0.116,明显高于癌旁正常组织(0.072±0.012)(t=6.862,P<0.05)。Circ-101555表达与肿瘤局部浸润、淋巴结转移及合并其他良性甲状腺疾病均密切相关(P均<0.05),而与患者年龄、性别、发病部位、肿瘤大小、TNM分期和钙化均无相关性(P均>0.05)。MTT增殖活性检测表明:过表达circ-101555或敲低circ-101555对甲状腺癌细胞的增殖活性均无明显变化(P>0.05)。侵袭和迁移实验表明:与对照组[(58.6±6.46)个]相比,过表达circ-101555甲状腺癌细胞的侵袭数目增多[(93.6±9.28)个],而敲低circ-101555甲状腺癌细胞的侵袭数目明显减少[(26.82±5.44)个];与对照组相比[(50.95±7.21)个],过表达circ-101555后甲状腺癌细胞的迁移数目增多[(81.6±9.98)个],而敲低circ-101555甲状腺癌细胞的迁移数目明显减少[(23.86±6.42)个],两组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。生物信息学预测并通过qRT-PCR实验验证miR-1178是circ-101555的下游靶基因;通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-1178与Wnt1的结合具有特异性,Wnt1是miR-1178的直接靶基因。Western blot和回复实验结果表明:无论circ-101555和miR-1178如何变化,Wnt1、β-catenin和MMP-9都受circ-101555的调控。结论甲状腺癌中circ-101555抑制了miR-1178表达,进而激活Wnt信号通路促进甲状腺癌的侵袭和迁移,可为circ-101555治疗转移性PTC提供理论依据。

circ-0008583结合EIF4A3蛋白促进肝癌细胞增殖并抑制其凋亡

目的探讨circ-0008583对肝癌细胞系增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法生物信息学分析联合临床样本和体外细胞实验验证circ-0008583在肝癌中的表达水平。RNase R和放线菌素D处理验证circ-0008583的circRNA特性。克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,TUNEL染色检测细胞凋亡。RIP实验检测circ-0008583和EIF4A3是否结合。qRT-PCR和Western blot检测基因表达水平。结果与正常肝组织及细胞系相比,circ-0008583在肝癌组织和细胞系中高表达(均P<0.001)。circ-0008583具有环状结构,与DLG1 mRNA相比,其稳定性增加(P<0.001)。与阴性对照组相比,干扰circ-0008583表达后肝癌细胞的克隆形成能力降低(P<0.01),凋亡水平上升(P<0.001)。Circular RNA Interactome数据库和RIP实验证实circ-0008583能够与EIF4A3蛋白结合。与正常肝组织及细胞系相比,EIF4A3在肝癌组织及细胞中高表达(P<0.001)。过表达EIF4A3能够在一定程度上逆转干扰circ-0008583表达对肝癌细胞增殖的抑制作用以及凋亡的促进作用。结论circ-0008583在肝癌组织及细胞系中高表达,其与EIF4A3蛋白结合促进肝癌细胞增殖,并抑制肝癌细胞凋亡。

circ-E2F3促进宫颈癌细胞增殖的机制研究

目的研究circ-E2F3通过抑制miR-296-5p影响宫颈癌进展的作用机制。方法采用qRT-PCR检测宫颈癌组织和癌旁组织中circ-E2F3的表达量,筛选宫颈癌细胞系,通过qRT-PCR检测宫颈癌细胞系和正常宫颈黏膜上皮细胞中circ-E2F3的表达量。采用CCK-8检测细胞活力,通过检索数据库筛查circ-E2F3可能的分子机制,并通过双荧光素酶分析、qRT-PCR等方法证实其调控机制。结果circ-E2F3在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系CaSki中表达上调。体外实验证实circ-E2F3能促进宫颈癌细胞增殖;体内实验证实circ-E2F3通过抑制miR296-5p促进肿瘤细胞生长。结论circ-E2F3通过抑制miR-296-5p在宫颈癌的进展中发挥重要作用,高表达的circ-E2F3可能是判断宫颈癌进展的重要指标。

白头翁皂苷A调控circ-0001742对鼻咽癌C666-1细胞恶性生物学行为影响实验研究

目的:探讨白头翁皂苷A对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响及分子机制。方法:体外培养人鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞系(HK-1、HONE1、CNE2、SUNE1、C666-1),实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中circ-0001742表达水平;将C666-1细胞分为si-circ-0001742组、si-NC组、对照组、白头翁皂苷A-L、M、H组、白头翁皂苷A-H+pcDNA-circ-0001742组;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell检测细胞迁移数,克隆形成实验检测细胞克隆数,蛋白质印迹法检测蛋白表达。结果:鼻咽癌细胞(HK-1、HONE1、CNE2、SUNE1、C666-1)中circ-0001742表达水平升高(均P<0.05)。沉默circ-0001742后,C666-1细胞增殖抑制率、细胞凋亡率以及活化的半胱天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)表达水平升高,C666-1细胞迁移和克隆细胞数减少(均P<0.05)。不同浓度白头翁皂苷A处理后,C666-1细胞增殖抑制率、细胞凋亡率以及Cleaved caspase-3表达水平升高,C666-1细胞迁移和克隆细胞数减少,circ-0001742表达水平降低,呈浓度依赖性(均P<0.05)。circ-0001742过表达可逆转白头翁皂苷A对C666-1细胞的抑制作用。结论:白头翁皂苷A通过下调circ-0001742抑制鼻咽癌C666-1细胞恶性生物学行为。

香芹酚对白血病细胞生物学行为的影响及其机制

目的:探讨香芹酚对白血病细胞生物学行为的影响及其对circ-0008717/miR-217分子轴的调控作用。方法:体外培养人急性淋巴细胞白血病细胞Molt-4,分别加入不同浓度的香芹酚处理细胞;si-NC、si-circ-0008717分别转染入Molt-4细胞(si-NC组、si-circ-0008717组),pcDNA、pcDNA-circ-0008717、anti-miR-NC、anti-miR-217分别转染入Molt-4细胞后加入香芹酚处理细胞(香芹酚+pcDNA组、香芹酚+pcDNA-circ-0008717组、香芹酚+anti-miR-NC组、香芹酚+anti-miR-217组);MTT、平板克隆形成实验、流式细胞术分别检测细胞活力、集落形成数、细胞凋亡率;RT-qPCR法检测circ-0008717和miR-217的表达量;双荧光素酶报告基因实验检测circ-0008717与miR-217的靶向关系。结果:经香芹酚处理后,细胞活力明显降低(r=-0.9405),circ-0008717的表达水平明显降低(r=-0.9117),集落形成数明显减少(r=-0.9256),细胞凋亡率明显升高(r=0.8464),miR-217的表达水平明显升高(r=0.9468);与si-NC组比较,si-circ-0008717组miR-217的表达水平升高(P<0.001),细胞活力降低(P<0.001),集落形成数明显减少(P<0.001),细胞凋亡率升高(P<0.001);与香芹酚+pcDNA组比较,香芹酚+pcDNA-circ-0008717组细胞活力升高(P<0.001),集落形成数明显增多(P<0.001),细胞凋亡率明显降低(P<0.001);circ-0008717可靶向调控miR-217的表达;与香芹酚+anti-miR-NC组比较,香芹酚+anti-miR-217组细胞活力明显升高(P<0.001),集落形成数明显增多(P<0.001),细胞凋亡率明显降低(P<0.001)。结论:香芹酚可通过下调circ-0008717的表达而促进miR-217的表达从而减弱白血病细胞增殖、克隆形成能力及促进细胞凋亡。

卵巢癌中环状RNA-101748高表达的病理意义及对增殖的影响

目的探讨浆液性卵巢癌(SOC)中环状RNA-101748(circ-101748)表达的病理意义及其通过调控微小RNA(miR)-340表达对卵巢癌细胞增殖的影响。方法收集SOC病例69例。采用RNA原位分子杂交技术(RISH)检测circ-101748在浆液性卵巢癌中的阳性表达情况,统计分析circ-101748阳性表达与SOC病理特征的关系;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)增殖活性实验检测circ-101748对卵巢癌细胞增殖的影响;基于生物信息学预测circ-101748的下游miRNA及其下游靶蛋白;通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和双荧光素酶报告实验验证circ-101748对miR-340的调控及miR-340对Ki-67的调控作用;通过回复实验证实circ-101748/miR-340信号轴对Ki-67的调控及对卵巢癌细胞增殖的影响。结果RISH结果显示,circ-101748阳性染色为棕黄色,定位于胞质和胞核;circ-101748阳性例数占比为73.91%(51/69),高于癌旁正常组织的11.59%(8/69),差异有统计学意义(P<0.05)。在SOC中,circ-101748的阳性表达与肿瘤直径(χ^(2)=9.763,P<0.05)、肿瘤分期(χ^(2)=9.656,P<0.05)密切相关,但与年龄、病理级别、淋巴结转移无关联(P>0.05)。MTT实验表明,过表达circ-101748后卵巢癌细胞的增殖活性显著升高,而降低circ-101748表达后卵巢癌细胞的增殖活性显著降低(P<0.05)。通过circBANK预测miR-340是circ-101748的靶基因;qRT-PCR结果表明,在卵巢癌细胞中过表达circ-101748后,miR-340表达水平显著下降(P<0.05),降低circ-101748表达后,miR-340表达水平显著升高(P<0.05)。双荧光素酶报告实验证实,circ-101748能与miR-340特异性结合,并可负性调控miR-340的表达。通过TargetScan和miRbase预测增殖蛋白Ki-67是miR-340的下游靶基因,进一步双荧光素酶报告实验验证表明,野生型Ki-673′非翻译区(3′UTR)可降低miR-340的荧光素酶活性,提示miR-340通过Ki-673′UTR抑制Ki-67蛋白的表达。回复实验结果表明,过表达miR-340可以消除circ-101748对卵巢癌细胞增殖蛋白Ki-67的促进表达作用,而过表达circ-101748或降低miR-340的表达可进一步激发卵巢癌细胞增殖蛋白Ki-67的表达;circ-101748能直接抑制miR-340的表达,而miR-340能直接抑制Ki-67的表达,circ-101748/miR-340/Ki-67信号通路在卵巢癌生长和增殖中起到显著促进作用。结论在卵巢癌中circ-101748为致癌基因,可通过调控miR-340/Ki-67信号轴促进卵巢癌细胞增殖和生长。

调控食管胃结合部腺癌增殖、侵袭能力的关键环状RNA分子的筛选与初步鉴定

目的:利用RNA高通量测序和生物信息学分析筛选出调控食管胃结合部腺癌(adenocarcinoma of esophagogastric junction,AEG)增殖、侵袭能力的关键环状RNA分子,并对其作用方式进行初步探究。方法:提取22对食管胃结合部腺癌组织及癌旁正常黏膜组织的RNA。采用RNA高通量测序(测序深度200×),利用生物信息分析云平台进行差异基因筛选,同时对差异表达的基因构建共表达网络和circRNAs-miRNAs-mRNAs间的内源性RNA竞争机制(ceRNA)网络;利用RNA图谱共表达网络构建和内源性竞争RNA负相关分析,筛选出在AEG发生过程中可能发挥关键作用的circRNAs。并预测可与该circRNA存在ceRNA关系的miRNAs和mRNAs;通过qRT-PCR等方法对该circRNA在胃癌组织、癌旁组织中的表达进行验证。结果:通过RNA高通量测序,共预测得到46553个circRNAs,对测序数据进行严格质控,得到26个差异表达的circRNAs(fold change≥2或fold change≤0.5,false discovery rate<0.05),其中10个circRNAs表达上调,16个circRNAs表达下调。对组织样本进行m RNA和miRNA测序分析,构建circRNAs-miRNAs-mRNAs间的ceRNA网络、RNA图谱共表达网络和内源性竞争RNA负相关分析。结果表明,hascirc0007766在AEG肿瘤组织中特异性高表达,可能在AEG发生发展过程中起关键作用;同时发现,miR4492与circRNA0007766和MET mRNA均有结合位点。结论:hascirc0007766可能通过miR4492-circRNA0007766-MET m RNA的ceRNA网调控食管胃结合部腺癌增殖、侵袭,是AEG发生发展的关键circRNA。