circKEAP1通过影响miR-661/LIF轴促进骨肉瘤细胞增殖和迁移

目的:探讨环状RNA circKEAP1通过影响微小RNA-661(miR-661),进而调控白血病抑制因子(LIF)基因促进骨肉瘤细胞凋亡和迁移的作用及其机制。方法:采用RT-qPCR探究不同骨肉瘤细胞系和成骨细胞hFOB1.19对照中circKEAP1的表达量,并通过一代测序验证其成环剪切位点。通过PCR验证circKEAP1在互补DNA与基因组DNA中的表达,并探究其在放线菌素D作用下的降解速率。构建circKEAP1的小干扰RNA,敲减circKEAP1后通过CCK-8、流式细胞术和细胞迁移实验评估骨肉瘤细胞143B活力、凋亡和迁移的改变。萤光素酶报告基因实验评估circKEAP1与miR-661的结合情况。通过CCK-8、流式细胞术和细胞迁移实验评估miR-661抑制剂对circKEAP1敲减的影响。转录组测序结合生物信息学分析预测circKEAP1的下游靶基因,并通过萤光素酶报告基因实验评估miR-661与LIF的结合情况。通过CCK-8、流式细胞术和细胞迁移实验评估LIF过表达对circKEAP1敲减的影响。结果:RT-qPCR结果显示,与成骨细胞hFOB1.19相比,多种骨肉瘤细胞系高表达circKEAP1(P<0.01)。circKEAP1存在于互补DNA中,而不存在于基因组DNA中,并且相对于其母基因KEAP1具有更好的稳定性。敲减circKEAP1显著抑制了143B细胞的生长,促进其凋亡,增加其迁移能力(P<0.01)。萤光素酶报告基因实验结果显示circKEAP1能与miR-661结合(P<0.01)。miR-661抑制剂可逆转敲减circKEAP1介导的细胞活力降低、凋亡增加和迁移能力减弱(P<0.01)。转录组测序结合生物信息学分析锁定下游靶基因LIF。萤光素酶报告基因实验结果显示miR-661能结合LIF(P<0.01)。RT-qPCR结果显示,敲减circKEAP1显著下调了LIF的mRNA水平(P<0.01)。在143B细胞中过表达LIF可逆转敲减circKEAP1介导的细胞活力降低、凋亡增加和迁移能力减弱(P<0.01)。结论:环状RNA circKEAP1能吸附miR-661,进而调控其下游靶基因LIF。circKEAP1-miR-661-LIF轴可能在骨肉瘤细胞的发生与进展中发挥重要作用。