重庆万州疑似柑桔轮斑病的病原鉴定及防治药剂筛选

为了明确2018年秋季起在重庆万州柑桔种植区新发生病害的病原菌和筛选有效防控药剂,通过组织分离法从患病样品中获得菌株,进行病原菌形态学、分子生物学和致病性鉴定,采用生长速率法测定不同药剂对目标菌株的毒力。结果表明,新发生病害的病原菌为柑桔轮斑病菌Pseudofabraea citricarpa。从尤力克柠檬病害样品上分离所得的病原菌WZ1菌株,对万州地区主栽的8个柑桔品种(尤力克柠檬、红桔、北京柠檬、塔罗科血橙、W·默科特桔橙、大雅柑、纽荷尔脐橙、北碚447锦橙)的叶、枝、果以及昭通苹果及砀山酥梨果实均具有致病性。50%甲基硫菌灵SC、30%碱式硫酸铜SC、50%啶酰菌胺WG、11.5%吡唑嘧菌脂EC、86.2%氧化亚铜WP、50%醚菌酯WP、3%噻霉酮ME、40%腈菌唑WP、99%噁霉灵DP、450g/L咪鲜胺EC、37%苯醚甲环唑WP、60%唑醚·代森联WP、25%嘧菌酯SC、250g/L戊唑醇EW、75%肟菌·戊唑醇WG、12.5%烯唑醇WP等杀菌剂,以及80%代森锰锌WP与50%啶酰菌胺WG 1∶64复配、80%克菌丹WP与37%苯醚甲环唑WP 1∶1复配,对病原菌菌丝生长有较强的抑制作用,可进一步用于田间试验。

3种柑橘病原真菌对苯醚菌酯和苯醚甲环唑敏感基线研究

黑点病(Diaporthe citri)、黑斑病(Guignardia citricarpa)和脂点黄斑病(Mycosphaerella citri)在柑橘上的发生日趋严重,导致产量下降和品质变劣。尽管加强栽培管理对病害的控制具有积极的作用,但药剂防治仍然是目前这几种病害的最有效途径。苯醚甲环唑是最近登记用于柑橘病害防治的DMI(14α-脱甲基酶抑制剂,14α-demethylation inhibitors)类杀菌剂,苯醚菌酯是我国自主研发的QoI(苯醌外部抑制剂,quinone outside inhibitor)类杀菌剂,具有应用于柑橘上述病害防治的潜力。本研究从全国各柑橘产区分离获得柑橘黑点病菌菌株48个,黑斑病菌菌株46个,柑橘脂点黄斑病菌菌株50个,在含药培养基上测定抑制50%菌丝生长和孢子萌发的药剂有效剂量(EC50值)。结果表明:黑点病菌、黑斑病菌和脂点黄斑病菌菌丝生长对苯醚菌酯的敏感基线依次为0.003,0.011和0.035μg/mL,对苯醚甲环唑的敏感基线依次为0.149,0.008和0.970μg/mL,黑点病菌孢子萌发对苯醚菌酯的敏感基线为0.001μg/mL。由此可见,我国柑橘黑点病菌、黑斑病菌和脂点黄斑病菌种群对苯醚菌酯敏感,黑斑病菌和脂点黄斑病菌种群对苯醚甲环唑敏感,显示这两个药剂在防治这些病害中的潜力。柑橘黑点病菌、黑斑病菌和脂点黄斑病菌种群苯醚菌酯和苯醚甲环唑的敏感基线的确定,可以为这些药剂推广后的抗药性监测奠定基础。

国内外柑桔黑斑病研究进展

为了更好地了解和掌握柑桔黑斑病,笔者就国内外柑桔黑斑病研究进展进行较全面的综述。该病害自发现以来,其研究不断深入,至今已报道了4种症状类型,病原菌分类地位经历了数次变更,基于ITS的分子检测技术极大提高了病原菌检测的准确性,化学防治仍是主要防治手段,但还有一些问题如病原菌的潜伏侵染机制不明确。目前柑桔黑斑病已扩散分布于南非、亚洲、澳洲、南美等地,危害表现日益严重,被欧美地区列为重要的检疫性病害,引起了相关部门的重视。

柑橘黑斑病菌生物学特性研究

本文测定了不同培养基、温度、pH、光照条件对柑橘黑斑病菌柑橘叶点霉(Phyllosticta citricarpa)菌丝生长和孢子萌发的影响,以明确其生物学特性。结果表明,该菌最适生长的培养基为燕麦片琼脂培养基(OA);菌丝最适生长温度为25～30℃,最适pH为5～7;在12h光暗交替条件下生长最好,全黑暗条件下生长最慢。分生孢子萌发最适温度为25℃,最适pH为6,以在0.2%葡萄糖溶液中的萌发率最高。菌丝和分生孢子在55℃水浴处理10min均失活。

柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系的优化

为了获得最优柑橘黑斑病病原菌柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系,利用单因素试验法对反应体系中的5个因素(Mg2+、d NTP、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA)分别设置了不同的浓度梯度进行反应体系的优化。结果表明,在20μL反应体系中,含有1.5 mmol/L的Mg2+、0.15 mmol/L的d NTP、0.3μmol/L的引物、25 ng DNA模板、0.5 U Taq DNA聚合酶为最优。利用优化的ISSR-PCR反应体系对不同地理来源的21株柑橘叶点霉菌菌株进行扩增。结果表明,已建立的体系稳定可靠。柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术对柑橘叶点霉菌进行遗传分析奠定了基础。

柑桔黑斑病菌杀菌剂的室内筛选

利用生长速率法对34种果园常用杀菌剂进行室内毒力测定。结果表明,各药剂在不同试验浓度下对柑桔黑斑病菌菌丝的生长均有不同程度的抑制作用,并且其抑制率与浓度呈正相关。其中苯醚甲环唑抑制效果最好,EC50为0.003 6mg/L;戊唑醇次之,EC50为0.126 2mg/L;其次为氟硅唑、丙环唑、甲基硫菌灵、腈菌唑、唑醚.代森联、烯唑醇、异菌脲、咪鲜胺,其EC50均在1mg/L以下。此研究为田间大面积防治柑桔黑斑病提供了参考。

柑橘黑斑病菌的分子检测技术研究

为了快速区分柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌,在ITS1和18S区域设计了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的上游引物,以ITS4作为下游引物,并对所设计引物的特异性和退火温度进行了筛选,对引物的灵敏度进行了验证,并进行了果园疑似病斑的检测。结果表明,在退火温度为60℃时,引物Pc1/ITS4仅能从柑橘黑斑病菌中扩增出593 bp的特异性条带,引物Pct4/ITS4仅能从首都叶点霉菌中扩增出551 bp的条带,引物Pcc1/ITS4仅能从中国柑橘叶点霉菌中扩增出706 bp的条带,不能从柑橘常见病害病原菌中扩增出任何条带。特异性引物的灵敏度检测结果表明,引物Pc1/ITS4和Pct4/ITS4的检测灵敏度为200 pg,引物Pcc1/ITS4的检测灵敏度为20 pg。筛选的特异性引物Pc1/ITS4可以对果园疑似柑橘黑斑病病斑进行检测。因此,利用设计的特异性引物Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pcc1/ITS4,结合简单的病原菌基因组DNA提取方法,可以在短时间内完成对病原菌的分子检测。

培养条件对柑橘黑斑病菌丝生长的影响

以南丰蜜桔黑斑病菌为实验材料，研究了不同生长环境下病原菌生物学特性。结果表明，病菌在5~35℃的范围内均能生长，25℃为菌丝生长的最适温度。适宜pH值范围为5～7，最适pH值为6；在不同培养基中，菌丝在PDA培养基上生长最快，在OA培养基上菌落周围产生一定量的黄色素；光照时间长短对菌丝生长几乎无影响。

柑橘种质对柑橘轮斑病菌的抗性评价

柑橘轮斑病是柑橘上的一种新型真菌性病害,挖掘和培育柑橘抗病品种是防控病害最经济、有效的方法.本研究采用柑橘离体枝条室内人工接种柑橘轮斑病菌的方式建立了柑橘种质抗柑橘轮斑病菌的评价方法,对不同柑橘种质进行抗性评价,并采用病情指数、病斑平均直径和聚类分析等方法对柑橘种质进行抗性分级.3种评价方法均将83个柑橘种质划分为5类:高抗、抗病、中抗、感病和高感,未发现免疫种质;其中有野生金豆、北京柠檬等16个高抗种质,金橘、金堂绿柚等10个感病种质,新会甜橘、立花橘2个高感种质.3种评价方法结果一致性较高.

柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性及其分子机制

为了对柑橘黑斑病和柚黑斑病提出更科学的化学防治方法,该文研究了柑橘黑斑病菌和柚黑斑病菌对杀菌剂多菌灵的抗性频率、抗性水平及其抗性分子机制。结果表明:在江西114个柑橘黑斑病菌株中发现了2个多菌灵抗性菌株,抗性频率为1.75%,抗性系数分别为5333.6和379.2;在四川32个柑橘黑斑病菌株中发现了1个多菌灵抗性菌株,抗性频率为3.13%,抗性系数为303.3;在浙江23个菌株和重庆3个菌株中没有出现抗性菌株。在广东收集的54个柚黑斑病菌株中发现了1个抗性菌株,抗性频率为1.85%,抗性系数为13719.5;在广西和福建分别收集的34个柚黑斑病菌株中没有发现抗性菌株。柑橘黑斑病菌和柚黑斑病菌对甲基硫菌灵和多菌灵存在正交互抗性,对嘧菌酯和多菌灵无交互抗性。因此,建议多菌灵可继续在柑橘黑斑病和柚黑斑病防治中使用,鉴于高抗菌株已出现,使用时应与其他作用机制的杀菌剂轮换使用。本实验还发现,柑橘黑斑病菌存在2种抗苯并咪唑类的分子机制,即β-微管蛋白基因上第198位氨基酸位点由谷氨酸突变为赖氨酸(抗性系数为5333.6的菌株)和第200位氨基酸位点由苯丙氨酸突变为酪氨酸(抗性系数为379.2的菌株);而柚黑斑病菌抗苯并咪唑类的分子机制则与β-微管蛋白基因第198位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸有关。

柑桔黑斑病的发病特点及检测方法研究进展

柑桔黑斑病(Citrus Black Spot,CBS)是一种真菌性病害,主要为害果实,并产生褐色斑点,严重时蔓延至全果,造成果实腐烂,显著影响果实的品质和外观,降低经济价值,被欧美等国列为重要的检疫性病害,近年来该病在我国一些柑桔产区已上升为主要病害。本文主要从柑桔黑斑病的病原菌、发病特点及检测方法等几个方面进行简要的概述。

柑橘轮斑病的适生区预测及风险分析

【目的】柑橘轮斑病(citrus target spot)作为一种新发柑橘病害,造成发病果园严重的经济损失。本研究针对该病害进行适生区预测及风险分析,以便对该病采取及时、有效的管控措施,最终达到降低其流行风险等级,防止病害传播扩展的目的。【方法】基于环境变量数据和柑橘轮斑病发生分布数据,运用MaxEnt生态位模型模拟预测柑橘轮斑病菌(Pseudofabraea citricarpa)在中国的潜在适生区分布。并通过ROC(receiver operating characteristic)曲线下面积(area under the curve,AUC)评估预测模型的精度,运用正规化训练增益刀切法(regularized training gain)获取气候因子与分布概率间的关系。同时采用有害生物风险分析理论,以有害生物风险分析的规定程序为依据探索柑橘轮斑病病害的风险分析体系和评价值的计算方法,对评价指标进行定性分析,进而量化评价值。在建立综合评价模型的基础上,计算柑橘轮斑病风险性危害值,最后对病害的风险性危害值进行评价。【结果】柑橘轮斑病菌MaxEnt模型预测结果的平均AUC值为0.998,表明预测结果精度高。柑橘轮斑病菌的潜在适生区面积约占全国面积12.19%,高适生区、中适生区、低适生区各占全国面积约2.85%、3.99%、5.35%。高、中适生区主要集中于长江中上游柑橘优势区及其周边。其中,高适生区主要集中在四川、重庆、陕西南部,以及贵州、湖北等少量地区。中、低适生区是高适生区的外围扩展。通过MaxEnt模型正规化训练增益刀切法获取的环境变量重要性分析结果表明,最冷季度平均温度(Bio11)、最干季度平均温度(Bio9)、最冷月最低温(Bio6)是影响柑橘轮斑病菌分布的3个关键环境因子,这意味着低温、干冷季节柑橘轮斑病发生可能性大。风险分析最终创建出5个准则层、13个指标层的多指标综合评价体系,并对各指标层定量与定性分析,柑橘轮斑病在我国的风险性危害值(R值)为2.08,处于高度风险等级,对长江中上游及湖北西部-湖南西部两大柑橘产区的潜在危害最大。【结论】柑橘轮斑病风险性较高,需要尽快建立监测体系,针对病害采取有效控制措施,阻止病害在长江中上游柑橘优势区及相邻柑橘产区传播。

柑橘轮斑病抗性鉴定方法的建立

【目的】探究柑橘轮斑病最适宜接种条件,建立一种快速鉴定柑橘轮斑病抗性的方法。【方法】以柑橘轮斑病菌为接种体,运用离体叶片接种法,在室内不同温度下对离体柠檬叶片的不同部位进行接种,探讨柑橘轮斑病的最适宜接种条件。随后采用前期确立的接种体系对27个主栽柑橘品种进行轮斑病抗性评价。【结果】针刺接种易发病,最适宜的接种温度为10℃,最适宜接种部位为叶片背部。27个柑橘品种中沙田柚为免疫品种,091无核沃柑最易感病。【结论】研究建立了叶片背面针刺、10℃条件下保湿培养28 d的抗性鉴定体系。并利用此技术体系鉴定出柚类抗病力最强,杂柑类相对最感病,而橙类、柑类与橘类抗性处于柚类与杂柑类中间。

广东梅州蜜柚柑橘黑斑病菌的检验鉴定

近年,柑橘黑斑病成为阻碍我国柑橘鲜果出口贸易的瓶颈,广东梅州名优鲜果蜜柚生产基地也遇到类似情况。该病发生后,病果果皮表面产生许多圆形病斑,初呈红褐色,中间凹陷,直径多为2~3mm,后期病斑逐渐转为褐色至黑褐色,病斑中部明显可见细小的黑色粒点状分生孢子器。病果分离物的培养性状与形态特征与柑橘黑斑病菌（柑橘球座菌,Guignarida citricarpa）一致。采用真菌ITS通用引物和柑橘球座菌特异性引物,从病斑组织基因组DNA及分离物基因组DNA中分别扩增得到541bp和396bp的片段。BLAST分析表明：扩增到的片段均与GenBank中已知柑橘球座菌菌株的rDNAITS序列相似性最高,分别为97%和98%。根据分离菌株的培养性状和形态特征及ITS区序列分析结果,将梅州蜜柚上的柑橘黑斑病菌鉴定为柑橘球座菌（Guignarida citricarpa Kiely）。

柑橘叶点霉属(Phyllosticta spp.)真菌的遗传多样性分析

利用筛选的11条ISSR引物对从我国柑橘主产区和国外收集的135株叶点霉属真菌菌株进行扩增,扩增产物进行凝胶电泳,扩增图谱用NTSYS-pc2.10软件进行群体聚类分析。结果显示,共扩增出116个DNA条带,其中多态性位点为112个,多态率为96.55%;平均每个引物可以扩增出10.55个条带,扩增产物大小在250~3 000 bp。聚类分析显示,中国柑橘叶点霉属真菌可以分为4个种,即P.citricarpa、P.citriasiana、P.capitalensis和P.citrichinaensis。以遗传相似性系数0.97为阈值时,柑橘黑斑病病原菌(P.citricarpa)种群可分为5个亚类,subclade-I的菌株来自中国的本地早、温州蜜柑、槾橘和南丰蜜橘,subclade-II的菌株均来自中国的砂糖橘,subclade-III的菌株来自非洲莫桑比克柠檬和葡萄柚、佛罗里达甜橙、南非甜橙和来自杭州市场上进口的澳橘,subclade-IV的菌株来自中国的甜橙,subclade-V的菌株来自中国的柠檬,表明我国柑橘黑斑病病原菌具有丰富的遗传变异,其遗传变异与寄主相关;我国与国外的柑橘黑斑病病原菌在起源上可能存在差异。P.citriasiana、P.capitalensis和P.citrichinaensis种群内也存在遗传变异,但其遗传变异与地理分布和寄主未发现相关性。该研究结果为研究柑橘叶点霉属真菌的遗传多样性奠定了基础。