Clostridium clariflavum DSM 19732木聚糖酶Xyn2441的克隆表达及条件优化

Clostridium clariflavum DSM19732是一种颇具应用价值的木质纤维素降解菌，尤其对半纤维素的降解能力非常高，国外学者已开始关注其中木质纤维素降解酶类的结构与功能，国内尚无相关报道。作者首次从复合菌系RXS基因组DNA中扩增出C．clariflavum DSM19732的一个表达双功能木聚糖酶（糖苷水解酶家族（glycosyl hydrolase family，GH）10和11的木聚糖酶）的基因Clocl-2441，并将其与载体pET28a（＋）连接，在大肠杆菌E．coli BL21（DE3）成功表达。重组菌最佳诱导表达条件为：添加诱导剂时的菌体量OD600值约为1．25、诱导剂IPTG浓度为0．5mmol／L、诱导时间7～8h及诱导温度25℃，此时胞内重组酶比酶活达到34．92U／mg。经镍柱初步分离纯化后比酶活达713．16U／mg，纯化倍数20．83倍，回收率27％。重组酶的最适反应温度和pH分别为70℃和6．5。

Clostridium clariflavum GH10木聚糖酶的克隆表达、酶学性质及位点功能分析

首次将来源于Clostridium clariflavum的木聚糖酶基因Clocl-2441中的糖苷水解酶家族10(glycosyl hydrolase families,GH)结构域基因连接到pET28a(+)载体上,在E.coli BL21(DE3)成功异源表达。经镍柱和脱盐分离纯化达到电泳纯,并对其酶学性质进行解析。结果表明,重组木聚糖酶rXyn2441GH10最适温度和pH分别为70℃和7.0,属于中性嗜热木聚糖酶。rXyn2441GH10在65℃以下和pH 4.0~9.0范围比较稳定,金属离子中5 mmol/L的Mg^(2+)可以提高79.2%的酶活。以榉木木聚糖为底物重组酶的动力学参数,V_(max)为1 691.5μmol/(mg·min),K_m值为2.5 mg/mL,k_(cat)为1 236.4/s,k_(cat)/K_m为494.6 mL/(mg·s)。定点饱和突变表明209位点的组氨酸对酶活有重要的作用。

双功能木聚糖酶Xyn2083的异源表达和酶学性质研究

木聚糖酶Xyn2083来源于Clostridium clariflavum,是一种双功能木聚糖酶,包括2个催化结构域GH11、GH10(glycosyl hydrolase families,GH)和一个非催化结构域DockerinΙ。在文中,将该双功能木聚糖酶基因及GH11、GH10这2个结构域的木聚糖酶基因成功在大肠杆菌Rosetta (DE3)中进行异源表达,得到了3个重组木聚糖酶。将纯化后重组酶进行酶学性质分析,结果表明Xyn2083的最适反应温度与p H值分别为60℃、6. 0,且在60℃以下或p H 4. 5～10. 5的范围内有较好的稳定性。水解反应研究表明,Xyn2083中GH11和GH10结构域协同作用于木聚糖底物,将木聚糖水解为木糖和木二糖。