桑叶多糖结构鉴定及其降血糖活性研究

目的阐明桑叶中具有降血糖活性的多糖结构基础,为桑叶的开发和利用提供理论基础。方法采用水提醇沉法获得桑叶粗多糖,经离子交换色谱和凝胶渗透色谱分离纯化获得SY02、SY02-3、SY02-3A及SY02-3B等多糖组分,并测定均一多糖的理化性质;联合单糖组成分析、糖残基连接方式分析和核磁分析对桑叶多糖进行结构鉴定;采用棕榈酸(Palimitate,PA)诱导INS-1细胞凋亡模型、Caspase3/7活性试剂盒测定桑叶多糖对INS-1E细胞凋亡的保护作用,并运用Western blot法检测桑叶多糖对INS-1E细胞凋亡关键蛋白Cleaved Caspase 3表达的影响。结果采用水提醇沉法获得桑叶粗多糖SY,经离子交换树脂柱分离再由凝胶柱纯化得到SY02-3,再次纯化后得到均一酸性多糖SY02-3A与蛋白多糖SY02-3B,两者分子量分别为3.7×10^(4)Da和1.03×10^(4)Da。单糖组成分析结果表明SY02-3A含有鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖,摩尔比分别为23.97:33.85:11.73:5.04:25.41,得率为0.32%;SY02-3B由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖与阿拉伯糖组成,其摩尔比19.83:10.34:45.42:9.01:2.23:13.17,得率为2.00%;SY02-3B含有14种氨基酸,其中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸含量相对较高。生物活性研究表明SY02-3可以保护PA诱导的INS-1E细胞凋亡,这种作用可能与降低Caspase 3活性和下调cleaved Caspase3蛋白表达有关。结论桑叶中含有酸性肽聚糖(SY02-3A)和蛋白聚糖(SY02-3B)的桑叶多糖SY02-3具有抑制PA诱导的INS-1E细胞凋亡的作用。

瞬时受体电位M2抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧细胞的保护作用

目的:探讨瞬时受体电位M2(TRPM2)抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧(OGD/R)细胞模型的保护作用。方法:采用SH-SY5Y细胞系制备OGD/R损伤模型。将细胞随机分为空白对照组、模型对照组和A10组。细胞计数试剂盒8检测细胞存活率;活性氧检测试剂盒检测细胞活性氧水平;四甲基罗丹明甲酯法检测线粒体膜电位;一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞数量;蛋白质印迹法测定cleaved caspase 3蛋白表达。结果:相对于3、20、30、50和100μmol/L,10μmol/L浓度的A10具有较低的细胞毒性及较好的通道活性抑制作用。与模型对照组比较,A10组活性氧水平降低(P<0.05),线粒体膜电位降低程度改善(P<0.05),凋亡细胞数减少(P<0.05),凋亡相关蛋白cleaved caspase 3表达减少(P<0.05)。结论:A10可以通过抑制TRPM2通道功能、减少细胞外钙离子内流、降低细胞活性氧水平、稳定线粒体膜电位水平和减少细胞凋亡缓解OGD/R后细胞的损伤。

键合表阿霉素纳米胶束对肝癌细胞和异体肝癌种植瘤凋亡的影响

目的 探讨键合表阿霉素纳米胶束（EPI-NPs）在肝癌Walker-256细胞以及肝癌异体种植肝癌瘤体大鼠组织中凋亡相关蛋白的变化,明确其对肝癌细胞凋亡的作用机制.方法 体外培养肝癌Walker-256细胞后,分为四组：正常组（更换培养液）、 空白键束组（5μg/ml空白键束培养液）、EPI组（5μg/ml EPI培养液）以及EPI-NPs组（5μg/ml EPI-NPs）.培养72 h后,Western Blot观察Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase3蛋白的变化.腹水移植法制作肝癌大鼠异体种植模型,CT检查确认荷瘤成功.荷瘤8 d将大鼠随机分为四组,荷瘤组、 空白键束组、EPI组和EPI-NPs组分别给予同体积的生理盐水、 空白键束（2 mg/kg）、EPI（2 mg/kg）及EPI-NPs（2 mg/kg）.治疗14 d后处死大鼠,留取荷瘤组织,观察瘤体大小和Western Blot观察Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase3的表达.结果 通过体外细胞实验发现：与空白键束组和EPI组相比,EPI-NPs组的Bax/Bcl-2值明显增高（P〈0.01）,同时发现Cleaved-caspase3也明显增高（P〈0.01）;体外实验发现：EPI-NPs组瘤体明显减小（P〈0.01）.与空白键束组和EPI组相比,EPI-NPs组Bax/Bcl-2值和Cleaved-caspase3明显增高（P〈0.01）.结论 键合表阿霉素纳米胶束能增高肝癌细胞和肝癌大鼠异体种植瘤的凋亡水平,可能通过线粒体凋亡途径发挥作用.

microRNA-21-5p在缺氧缺血新生大鼠脑组织中的表达及对其生物学功能研究

目的探讨microRNA-21-5p(miRNA-21-5p)在缺血缺氧性脑损伤(HIBD)的新生大鼠脑组织中的表达及其作用机制。方法将7 d龄SD大鼠双重结扎左侧颈总动脉后并从双线中间离断血管,构建大鼠HIBD模型,并随机分为模型组、对照组和实验组,每组20只;另取20只大鼠不做血管离断作为空白组。在造模后第2天,大鼠麻醉并对脑组织进行微量注射,实验组及对照组分别给予稀释后的miRNA-21-5p agomir和miRNA-21-5p NC 10μL,空白组和模型组均给予等体积0.9%NaCl。造模后第7天,用神经功能缺损程度(NDS)评分法评价神经功能损伤程度,用实时荧光定量聚合酶链反应检测大鼠脑组织中miRNA-21-5p的表达,用生物信息学预测miRNA-21-5p与PI3K的关系,用蛋白质印迹法检测PI3K、p-Akt和Cleaved Caspase 3蛋白表达。结果模型组、实验组和对照组的NDS评分分别为(4.70±0.71),(2.45±0.50)和(4.40±0.49)分,miRNA-21-5p相对表达量分别为(0.24±0.02),(0.71±0.10)和(0.25±0.01),模型组的上述指标与实验组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。经Target Scan数据库预测PI3K与miRNA-21-5p存在结合位点,推测两者可能具有靶向调控关系。模型组、实验组和对照组的PI3K相对表达量分别为(0.37±0.01),(0.65±0.02)和(0.37±0.01),p-Akt相对表达量分别为(0.42±0.04),(0.74±0.01)和(0.41±0.03),Cleaved Caspase 3相对表达量分别为(2.02±0.04),(1.40±0.03)和(2.02±0.04),模型组的上述指标与实验组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论miRNA-21-5p在新生HIBD大鼠脑组织中低表达,其可能通过PI3K/Akt/Cleaved Caspase 3信号通路参与神经细胞凋亡过程。

双环醇改善大鼠肺纤维化的机制研究

目的观察双环醇对博来霉素诱导大鼠肺纤维化的干预作用,并进一步探讨其可能的作用机制。方法将♂SD大鼠随机分为5组:对照组,模型组,双环醇低、中、高剂量组,每组10只。除对照组外,其他4组均用单次气管内注入博来霉素的方法复制大鼠肺纤维化模型,造模成功24 h后双环醇各剂量组分别给予不同剂量双环醇片溶解后灌胃,对照组和模型组相同条件下注入等体积生理盐水,观测5组大鼠一般情况,根据双环醇不同剂量组大鼠生存率情况,选择生存率最高组和对照组、模型组进行下一步实验。观测3组大鼠肺组织病理变化,行肺纤维化Ashcroft评分及肺泡间隔厚度测定,检测肺组织中pro-caspase 3、cleaved caspase 3、Bcl-2和Bax的表达。结果各造模组中双环醇高剂量组生存率最高(P<0.05),故选择双环醇高剂量组作为双环醇组继续实验。与模型组相比,双环醇组肺泡结构破坏及肺间质纤维化程度减轻,肺纤维化Ashcroft评分明显降低(P<0.01),肺泡间隔厚度明显变薄(P<0.01),Bax和cleaved caspase 3表达水平均显著降低(P<0.01),Bcl-2升高(P<0.01)。结论双环醇对博来霉素诱导大鼠肺纤维化具有明显的保护作用,而其作用机制可能与通过干预Bcl-2、Bax和cleaved caspase 3影响细胞凋亡改善肺纤维化有关。