抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素原核表达载体的构建及其对虫体的杀灭作用

目的构建抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素原核表达载体并测定表达产物对隐孢子虫的杀灭作用。方法利用基因工程原理,以含抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素的菌株为模板,利用设计合成的一对引物扩增出ScFv-PE,利用pMAL-p2X载体构建重组毒素pMAL-ScFv-PE,并将其导入大肠杆菌中进行表达,产物进行SDS-PAGE和Western-blot,纯化后治疗感染隐孢子虫的小鼠。结果重组质粒经酶切鉴定正确,IPTG诱导后可看到明显的条带。凝胶薄层扫描分析目的蛋白表达量占菌体蛋白总量的21%。纯化后的表达产物治疗感染隐孢子虫的小鼠治疗组比对照组肠滞留物中卵囊计数(P<0.05)与肠道平均累计感染积分明显减少(P<0.01)。结论利用原核表达载体成功构建了可溶性形式表达的pMAL-ScFv-PE重组质粒,重组毒素对隐孢子虫具有明显的杀灭作用。

抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定

为构建克伦特罗(Clenbuterol,CBL)单链抗体(scFv)表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E-CBL质粒为模板,扩增CBL的scFv基因,与pPICZαA载体重组,然后以重组质粒pPICZαA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6个组氨酸(6×His)片段,再与载体pBV220连接,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片段的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段,与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37kD,能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为4.55ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达,为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。

抗IL-4R单链抗体原核表达载体的构建与表达

目的通过BL21(DE3)原核表达系统制备抗白细胞介素-4受体(IL-4R)鼠抗人单链抗体(scFv)。方法在前期研究结果的基础上优化抗IL-4R scFv序列,优化后分析scFv序列,构建重组质粒pET-32a-scFv,将该重组质粒酶切鉴定,将其转入BL21(DE3)原核表达菌进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析检测,对表达蛋白进行纯化和复性,通过SDS-PAGE分析抗IL-4R单链抗体的分子质量,运用Western blot检测融合蛋白的特异性。结果插入pET-32a载体的scFv序列长度761 bp,抗IL-4R单链抗体的分子质量在45 ku左右,重组蛋白具有较高的特异性。结论本实验成功构建pET32a-scFv原核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫反应性,为进一步研究抗IL-4R单链抗体作为药物靶点提供了工作基础。