重组人角质细胞生长因子-2基因克隆、表达、纯化与活性分析

从人胚肺二倍体细胞KMB17中抽提总RNA ,经RT PCR扩增获得编码人角质细胞生长因子 2 (keratinocytegrowthfactor 2 ,KGF 2 )的cDNA .克隆于硫氧环蛋白表达载体pThioHisA ,序列分析表明与文献报道一致 .经IPTG诱导 ,在大肠杆菌BL2 1中实现高效表达 ,表达量可达菌体总蛋白 10 %～15 % .菌体超声破碎 ,上清经CM SepharoseFF阳离子交换 ,Heparin Sepharose亲和层析 ,Superdex 75凝胶过滤层析纯化得到重组人KGF 2 ,纯度高于 95 % .生物活性分析表明 ,它能够促进成纤维细胞NIH 3T3的增殖 ,诱导鸡胚背根神经结神经轴突的生长 ,促进鸡胚尿囊膜血管生成 .研究结果表明 ,获得了 95 %纯度的具有生物学活性的重组人KGF 2 。

龙眼FLO/LFY同源基因cDNA片段的克隆

根据不同植物FLO LFY同源基因3′端保守序列,设计简并引物,运用RT＿PCR技术在龙眼花芽总RNA中扩增得到长度为408bp的cDNA片段,命名为lonFLO。序列分析表明,该片段与金鱼草FLO、苹果AFL2、AFL1、拟南芥LFY有较高的核苷酸同源性,分别达98 8%,81 6%,81 1%和76 2%。

IBDV南京野毒株VP2结构蛋白基因克隆与表达

用微机辅助设计合成了一对引物，用于扩增传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）中国地方株ＶＰ２基因片段。ＲＴＰＣＲ扩增出一１３２１ｂｐ的目的片段，分子杂交鉴定为ＶＰ２基因。扩增产物经双酶切后插入含噬菌体ＰＲＰＬ双强启动子的ｐＣＹＴＥＸＰ１表达质粒，构建了ＶＰ２基因克隆ｐＣＶＰ２１，经ＤｏｔＥＬＩＳＡ筛选出４个ＶＰ２表达阳性克隆。ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示有一约３２０００的目的蛋白带，且能与ＩＢＤＶ阳性血清结合。

中国人神经珠蛋白(NGB)基因克隆与序列分析

应用RT_PCR方法从中国人胎脑组织中扩增出神经珠蛋白(NGB)特异性编码基因片段,并将其克隆到pMD18_TVector中,构建了pMD18_T_hNGB克隆质粒,然后进行测序分析并与国外报道的NGB序列相比较.结果表明,本文获得的中国人NGB编码基因序列与国外序列的同源性为98%.

NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定

目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的 为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法 根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列， 设计一对引物， 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段， 全长１－０８ｋｂ； 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后， 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体， 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株， 重组克隆经筛选后， 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞， 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆； 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压， 以表达重组ＣＳＰ， 分离细胞培养上清和培养细胞， 进行ＳＤＳＰＡＧＥ分析。结果 （１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区， 中央重复区和Ⅱ区编码序列；（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点； （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原， 其分子量为３８－３ｋＤａ， 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。

Galectin-1表达对LoVo细胞表型的影响

目的观察galectin-1表达对LoVo细胞表型的影响。方法构建galectin-1真核表达载体,转染LoVo细胞,细胞免疫化学检测蛋白质水平的改变,dot-blotting检测细胞培养上清分泌性galectin-1,观察LoVo细胞表型变化。结果成功构建了galectin-1真核表达载体,并建立了稳定的真核表达载体转染LoVo细胞系。galectin-1表达可降低LoVo细胞与Ⅰ型胶原的粘附,促进细胞同质粘附,且降低细胞体内成瘤(P<0.001)。结论Galectin-1表达可降低LoVo细胞恶性相关表型。

鄂东杰构——阳新县祠堂建筑及文化特征初探

该文通过时湖北省阳新县祠堂的分析研究,探寻和阐述了阳新当地祠堂的形成过程、历史文脉、空间形态和独有特征。

L-缬氨酸浓度对胃癌细胞生长、克隆形成率及膜通透性的影响

通过细胞计数、蛋白合成率、克隆形成率及培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活力测定,观察L-缬氨酸(L-Val)浓度对培养胃癌细胞(MKN_(45))及对照细胞(纤维母细胞IMR-90)的影响,发现将L-Val减少至标准MEM(Minimum Eagle Medium)L-Val浓度(4.6 mg/100 ml)的1/16或1/8时,胃癌细胞计数、蛋白合成率及克唐形成率显著降低;而培养基中LDH活力显著上升(P<0.05),纤维母细胞则无类似变化。L-Val浓度加倍或剥夺MEM中L-亮氨酸或L-蛋氨酸对这两种细胞这些特性均无影响。上述结果为配制胃癌不平衡氨基酸治疗液提供了基础。

自适应免疫克隆粒子群算法的地震波阻抗反演

针对粒子群优化算法应用于地震波阻抗反演问题时易陷入局部极小值和计算量大的问题,提出一种自适应免疫克隆粒子群(AICPSO)算法。该算法引入免疫机制,根据个体浓度和适应值概率定义了个体置换算子,能够避免粒子群算法陷于局部极值。为避免由进化过程中大量相同抗体引起的算法退化现象,根据记忆库和抗体群不同的特性,采用自适应变异算子更新记忆库,而依据抗体浓度和亲和度更新下一代抗体群体。经数值模拟和实际波阻抗资料反演表明,该算法不依赖于初始模型,收敛速度快且结果可靠。免疫粒子群优化算法为解决地震波阻抗反演问题提供了一条可行途径。

包心菜无菌苗子叶及叶片原生质体高频分裂和高频植株再生

以包心菜子叶和叶片原生质体为材料。经不同液体培养基(Bp1,Bp2,B1)浅层培养,再生细胞高频分裂并形成愈伤组织。愈伤组织经扩增后转移到分化培养基上诱导植株分化,从这两种原生质体中获得了再生植株。在原生质体培养过程中,原生质体及细胞团的褐化程度与培养基中的有机成分的多少有关。原生质体的分化频率与培养基中植物激素种类关系甚大。在植株分化时,谷氨酰胺和腺嘌呤对植株分化有很大促进作用。另外,原生质体的来源及原生质体培养基对原生质体植株分化能力均有不同的影响。

镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP基因的克隆和重组表达

为了进行抗蜱及蜱传病疫苗的研究,本试验根据GenBank中的镰形扇头蜱组胺结合蛋白(Rhipicephalus haemaphysaloideshistamine bindingprotein,RhHBP)基因cDNA序列,设计一对特异性引物(内含EcoRI/XhoI酶切位点),经RT-PCR扩增了镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP的cD-NA,大小为603 bp,将其克隆到pGEM-Teasy中并测序。在去除编码RhHBP信号肽的核苷酸序列后,将其亚克隆到pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1-RhHBP,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为1 mmol/L IPTG诱导其表达,表达的融合蛋白大小为49 ku,以包涵体的形式存在。Western Blot分析表明,该蛋白具有良好的免疫原性。

植物抗病基因研究进展

迄今为止已从植物中克隆出近30个抗病基因,基因编码产物具有富亮氨酸重复(LRR)、丝—苏氨酸蛋白激酶(STK)结构域及核苷酸结合位点(NBS)等结构特征。植物抗病基因的克隆方法主要有转座子标签技术和图位克隆技术等。

鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备方法的比较

提取鸡X期胚盘细胞,体外培养传至第3代,采用口吸管法、细胞稀释法及克隆环法将细胞集落分离成单个细胞,并将其接种至96孔板上,每孔1个细胞,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物,探讨鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备的实际操作的可行性,并对其生物学特性进行鉴定。结果表明:口吸管法、克隆环法、细胞稀释法克隆率分别为0、1.0%、4.2%。3种方法相比较,细胞稀释法具有操作简单易行、实验时间短、对细胞伤害小等优点,经碱性磷酸酶活性和阶段特异性表面抗原1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖且不分化。

巨噬细胞移动抑制因子基因的克隆和原核表达

目的:扩增、克隆人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组MIF蛋白。方法:根据人MIF基因序列,设计、合成PCR引物,利用RT -PCR技术从人T淋巴细胞mRNA中扩增MIF基因。将MIF定向插入原核表达载体pGEX - 4T - 1,并将构建正确的重组表达载体pGEX - 4T -MIF转化工程菌BL2 1(DE3) ,用异丙基硫代- β-D -半乳糖(IPTG)诱导表达重组MIF蛋白。用GSTrap亲合柱纯化表达产物GST-MIF ,行柱上凝血酶消化,洗脱获得MIF蛋白。用巨噬细胞移动抑制试验(MMI)鉴定MIF蛋白的生物活性。结果:限制性内切酶分析和DNA测序结果表明,成功构建了重组质粒pGEX - 4T -MIF ,人MIFcDNA长348bp ,编码115个氨基酸。经IPTG诱导,高效表达出可溶的GST -MIF蛋白。SDS -PAGE和Westernblotting分析显示,GST -MIF经凝血酶消化,获得13kU的MIF蛋白。MIF蛋白对巨噬细胞移动的抑制率达30 % ,具有生物活性。结论:克隆、测定了人MIF基因,在大肠杆菌表达出具有生物活性的MIF蛋白。

par-4 SAC基因的克隆及序列测定

目的:利用基因工程技术对par-4 SAC进行基因克隆并测定其序列,为进一步诱导肿瘤细胞靶向性凋亡的基因治疗奠定基础。方法:采用非对称互补引物/模板法,制备两端含有酶切位点的par-4 SAC的cDNA,PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体并转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α菌株,随机挑取数个菌落,筛选鉴定并测序。结果:经酶切鉴定、测序分析,表明所插入的基因片断为par-4 SAC基因,与设计完全相同。结论:应用非对称互补引物/模板法克隆par-4SAC基因是成功及可行的。

元宝枫优质叶用品系选育方式的探讨

[目的]通过对不同系号元宝枫叶片形态特点和叶片中6种药用成分含量的分析,为黄酮类、酚类化合物的定性定量检测、元宝枫叶茶的开发利用及优良无性系的筛选提供参考。[方法]采用常规方法测定叶片形态指标、超声提取和HPLC法检测叶片药用成分。[结果]叶片形态的变异情况为叶柄长>裂宽>裂长>叶长>叶宽>叶基角,叶片裂宽大都在2 3 cm左右,叶基角除6-1外,都小于180°。叶片中槲皮素、山奈酚、异鼠李素、儿茶素、绿原酸、咖啡酸平均含量分别为2 979.65、1 474.92、268.12、1 380.18、218.28、8.13μg·g-1。元宝枫的叶柄长与绿原酸含量的相关系数是-0.735*;鲁红1号母树与其无性繁殖幼树叶片药用成分的相关系数达到0.914*。6号系列黄酮类物质含量较高,而1号系列酚类物质含量较高。不同家系、同一家系的不同无性系叶片药用成分也有显著差异。[结论]叶用元宝枫无性系的选育可尝试采用间接选择的育种方式,例如可以通过选择叶柄长来改良绿原酸含量;叶片药用成分含量的幼成相关关系表明元宝枫叶片药用成分含量的早期选择也是可行的;家系内不同无性系叶片药用成分的显著差异揭示了元宝枫家系内选择的必要性;鲁红1号的叶较大、各药用成分含量较高,且秋季叶色变红,可以作为药与赏兼用的优质品系资源。

人胰岛素样生长因子-Ⅱ基因cDNA克隆与序列分析

本研究通过RT-PCR技术从人胎盘组织中扩增出长为841bp的胰岛素样生长因 子-ⅡcDNA,PCR产物经凝胶回收纯化后,克隆在PGEM-T载体的T位点。测序结果和序列分 析表明,本人已成功地扩增、克隆了人胰岛素样生长因子-Ⅱ基因cDNA序列。

藏酋猴类似人clock基因片段的克隆

目的:在藏酋猴中,寻找和克隆与人clock基因类似的基因。方法:提取藏酋猴外周血白细胞RNA,逆转录为全基因组cDNA,利用人clock基因保守序列设计相关引物,克隆,测序,进行生物信息学分析。结果:扩增得到1994bp的核酸序列。该序列与人,苏门答腊猩猩,绵羊,小鼠,褐家鼠,原鸡和蟾蜍clock基因核酸序列同源性分别为99%,98%,94%,90%,90%,82%和75%。结论:藏酋猴基因组中存在与人clock基因相似的基因,该基因可能为藏酋猴clock基因。

人胰岛细胞自身抗原69ku蛋白基因的分离及重组质粒鉴定

目的:应用聚合酶链技术获取作为基因探针和体外表达研究所必需的人胰岛细胞自身抗原69ku蛋白(hICA 69)编码基因,为探讨该基因在不同种系间和(或)组织来源间的差异打下基础。方法:分别从正常白人胰腺细胞和国人胰岛细胞瘤Poly(A^+)-RNA中逆转录合成编码人胰岛细胞自身抗原69ku蛋白(hICA 69)的全长cDNA,以双链cDNA(ds cDNA)为模板,经聚合酶链反应(PCR)特异性扩增出hICA 69基因的编码序列。利用基因重组技术,将纯化的目的基因插入pSPORT1质粒的多克隆位点,经限制性内切酶加以初步鉴定。结果:成功地扩增了hICA 69基因,并正确地克隆进pSPORT1载体,酶切鉴定筛选出正向插入重组子,其结果与预期值一致。结论:hICA 69基因的克隆为应用基因工程技术生产胰岛细胞自身抗原、生产适用于1型糖尿病诊断的试剂盒打下一定的基础。