微孔板杂交法测定椰毒假单胞酵米面亚种的DNA-DNA同源性

采用一种新的DNA DNA杂交方法—微孔板法对椰毒假单胞菌酵米面亚种及伯克霍尔德氏菌属中 1 1个种的DNA DNA同源性进行测定。结果发现椰毒假单胞菌酵米面亚种与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及椰毒伯克霍尔德氏菌的DNA DNA同源性均大于 75% ,建议这 3个种应合并为同一个种 ,命名为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 (Burkholderiagladioli)。

用rDNA指纹图分析我国部分椰酵假单胞菌的分子流行病学特征

椰酵假单胞菌的染色体ＤＮＡ经ＢｇｌⅡ＋ＥｃｏＲＶ同时消化后分离，用生物素标记的１６Ｓ＋２３ＳｒＤＮＡ探针杂交，制备其ｒＤＮＡ指纹图。用ｒＤＮＡ指纹图分析方法将５１株椰酵假单胞菌分为２０个核糖型，其中ＲＴ６、９、２包含了一半以上菌株（占５２．９％）。一个省（市）常同时存在２个或２个以上的核糖型，其亲缘关系有近有远；尽管有的核糖型在不同省（市）交叉分布，但各核糖型都分别局限于部分区域。在贵州、江苏、河北３个省的４起食物中毒样品中分离到同一核糖型（ＲＴ６）的菌株，说明这４起食物中毒事件的发生有密切的联系，它们可能由同一克隆的菌株所引起。借助于核糖型分类和聚类分析结果，推断不同菌株间的亲缘关系，为追踪椰酵假单胞菌的传播途径、探讨其进化关系和流行规律提供了一种有效的手段。

糖对椰酵假单胞菌产毒性能的影响研究

以半固体ＬＡ和营养琼脂为基础培养基，分别加入葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油等４种成分，研究糖分对椰酵假单胞菌产毒性能影响。结果表明，椰酵假单胞菌在营养琼脂和ＬＡ半固体基础培养基上基本不产毒或产毒量很低，而葡萄糖和甘油的加入使椰酵假单胞菌的产毒能力大幅度提高，产毒量不低于在马铃薯葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）中，提示了糖代谢在椰酵假单胞菌生长和产毒过程中的重要作用。建议将ＬＤＡ（含葡萄糖的ＬＡ，新设计）半固体做为一种新的椰酵假单胞菌产毒培养基。

云南省椰毒假单胞菌酵米面亚种污染分析及PFGE分型

目的 椰毒假单胞菌酵米面亚种的分布和传播情况。方法 对59份样品进行细菌分离与鉴定,用限制性内切酶SpeI酶切17株椰酵假单胞菌染色体DNA以进行脉冲电泳(PFGE)分析。结果 采集样品59份,分离鉴定出椰酵假单胞菌14株,检出率为23.73%,17株菌的PFGE图谱的相似性系数在53.6%~100%之间,经聚类分析得到14个PFGE型别。结论 云南省部分地区椰酵假单胞菌污染严重,存在食品安全隐患,应进一步从食品源头加强卫生监测;PFGE带型呈多样性,对今后云南省椰毒假单胞菌酵米面亚种引起食物中毒的诊断和溯源有重要意义。

ELISA检测椰酵假单胞菌菌体抗原的研究

椰毒假单胞菌酵米面亚种,已知有0—Ⅲ、0—Ⅳ和0—Ⅴ等菌体抗原型。常规血清试管凝集法检测分型耗时费力。本文在制备不同血清型菌体抗原的抗体和辣根过氧化物酶抗体结合物的基础上,建立了检测椰酵假单胞菌的间接非竞争法、直接非竞争法和双抗体夹心ELISA法,具有快速、简便和较好的特异性。

部分椰酵假单胞菌的产毒力与核糖型分布间的关系

用ｒＤＮＡ指纹图对４２株椰酵假单胞菌进行核糖型分类，探讨该菌的产毒力与核糖型分布之间的关系。结果表明，７３．８％的菌株具有产毒力，它们分布在大多数核糖型中，来源于食物中毒样品及正常食物样品。而产毒力阴性菌株只占２６．２％，它们集中于少数核糖型中，而且都来源于正常食物样品。多个克隆产毒力阳性菌株的广泛存在，提示对该菌的潜在性危害应引起足够的重视。

用单克隆抗体验证椰毒假单胞菌酵米面亚种O抗原型的初步研究

用椰毒假单胞菌种特异性Ｏ－Ⅰ因子及型特异性Ｏ－Ⅳ因子的单克隆抗体Ｐｃｏ６５和Ｐｃｏ１３对从中毒银耳、正常玉米面及动物饲料中新分离的９３株椰毒假单胞菌的菌体抗原型进行了验证。ＥＬＩＳＡ判定结果表明，除１株经再次生化验证鉴定为非椰毒假单胞菌呈阴性反应外，９２株菌均含有种特异性Ｏ－Ⅰ因子，阳性符合率为１００％，其中，４７株菌含有Ｏ－Ⅳ型特异因子，占总菌数的５１．０９％，比血清学分型率（４０．２３％）高出１０．８７％。研究结果表明，鉴定椰毒假单胞菌Ｏ抗原型时、联合应用种间和型间特异性单克隆抗体进行ＥＬＩＳＡ检测，可同时定种分型，方法灵敏、快速，重复性良好。

椰毒假单胞菌酵米面亚种寄生菌的研究

1989年,作者从北京永定河河水、陶然亭湖水中分离到能裂解大肠杆菌的噬菌蛭弧菌。再以椰毒假单胞菌酵米面亚种(简称,椰酵菌)为宿主菌,在双层琼脂平板上培养,4～6天后形成无菌落生长的噬斑。在电镜下观察,证明噬菌蛭弧菌有裂解椰酵菌的能力,同时观察到一种新的瓜子形细菌也有侵袭椰酵菌的能力,值得进一步研究探讨。

椰毒假单胞菌及其酵米面亚种诱变性的研究

选取十二烷基磺酸钠或溴化乙锭(EB)为诱变剂,采用高温连续传代培养法处理椰毒假单胞菌株(NCIB 9450)和部分典型的强产毒椰毒假单胞菌酵米面亚种菌株(Co7、Co5、Co14和HN892y 等),筛选出4株失去产毒能力的菌株:Co14S,Co5S,Co7S 和 P.coS。处理后的菌株一般生物学性状没有改变。

2018年广东省米面制品、淀粉及其制品中椰毒假单胞菌酵米面亚种的调查分析

目的调查分析2018年广东省米面制品、淀粉及其制品中椰毒假单胞菌酵米面亚种。方法在广东省中选取粉丝粉条、河粉米粉等米面制品、淀粉及其制品的企业、超市、农贸市场及餐饮单位为采样点,随机抽取1570份样品按照GB/T 4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》进行检验和VITEK2鉴定。结果 1570份样品中5份检出唐菖蒲伯克霍尔德菌,其中只有1份检出椰毒假单胞菌酵米面亚种,检出率为0.06%(1/1570)。结论米面制品、淀粉及其制品中检出唐菖蒲伯克霍尔德菌,表明广东省米面制品、淀粉及其制品中存在被椰毒假单胞菌酵米面亚种污染风险。为最大限度降低或消除风险隐患,相关部门应加强安全监管,保障人民群众身体健康和饮食安全。

食品中椰毒假单胞菌酵米亚种实时荧光PCR检测的研究

目的建立食品中椰毒假单胞菌酵米面亚种实时荧光PCR检测方法。方法根据椰毒假单胞菌酵米面亚种16S^23S rRNA基因片段序列,用Oligo7设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,摸索最佳退火温度,最佳引物和探针浓度,建立椰毒假单胞菌酵米面亚种实时荧光PCR检测方法。通过对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌以及22种其他标准菌株进行实时荧光PCR检测,验证本法的特异性和抗干扰性。同时从菌液浓度和DNA浓度水平上进行研究,确定该检测方法的灵敏度。结果用该方法检测23种菌,除唐菖蒲伯克霍尔德氏菌外,其他22种细菌均为阴性。抗干扰性试验显示杂菌对检测结果不影响,本法抗干扰能力强。通过灵敏度试验的研究,确定本法检测椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌液灵敏度为1×10^2 CFU/mL,DNA灵敏度为250 fg/μL。结论本试验设计的引物和探针具有较强特异性、抗干扰性以及灵敏度,该方法具有很好的研究价值和应用前景。

椰毒假单胞菌酵米面亚种菌株保存方法的研究

用ｐＨ６．８磷酸盐缓冲液鸡蛋斜面、ＰＤＡ斜面和玉米粉３种材料，覆以液体石蜡作保存椰酵假单胞菌效果研究，结果以ｐＨ６．８磷酸盐级冲液鸡蛋斜面覆以液体石蜡，放于室温或４℃冰箱，被保存菌株１６个月或１２个月仍存活，而且保存后菌种的生物学特性与保存前相比未见明显变异。

云南省文山州广南县吊浆粑食物中毒事件的病原学分析

目的分析云南省文山州广南县一起吊浆粑食物中毒事件,鉴定引起中毒的致病因素。方法在流行病学调查的基础上,对采集的4份食物样品参照GB/T 4789.29—2003进行微生物常规培养,对其中分离的疑似目标菌株进行VITEK 2 COMPACT生化鉴定和16S rRNA序列比对,并对样品进行动物中毒试验,采用液相色谱-质谱联用方法对样品中的米酵菌酸进行定量分析。结果分离的3株食源性致病菌的16S rRNA序列比对和VITEK 2COMPACT生化鉴定结果均为唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli),均可产毒使小鼠死亡,且样品中米酵菌酸含量超标,产毒量最高达9.67 mg/kg。结论该食物中毒事件是由唐菖蒲伯克霍尔德菌污染吊浆粑,产生大量米酵菌酸所致。从试验过程和结果分析,该菌株应为我国命名的椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonas cocovenenans subsp.farinofermentans)。

椰毒假单胞菌酵米面亚种选择性分离培养基的比较研究

目的比较4种椰毒假单胞酵米面亚种选择性分离培养基(马铃薯葡萄糖琼脂,PDA;改良马铃薯葡萄糖琼脂,mPDA;椰毒假单胞菌酵米面亚种分离琼脂,PCFA;银耳卵黄氯霉素琼脂,TYCA)的分离效果,为修订GB/T4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》提供技术支持。方法接种椰毒假单胞菌酵米面亚种于4种选择性分离培养基,观察各培养基上目标菌菌落形态,计算生长率;接种10种常见致病菌和环境中常见菌于4种选择性分离培养基,进行生长特异性试验;通过直接涂布和增菌划线的加标试验,验证这4种选择性分离培养基对粪便、食品和环境土壤等不同标本/样品中椰毒假单胞菌酵米面亚种的分离检出情况。结果 mPDA和PCFA能够分别抑制8种和6种致病菌的生长,且椰毒假单胞菌酵米面亚种的生长率都高于75%;在mPDA和PCFA上,目标菌与多数杂菌形态有明显区别,而在PDA和TYCA上,形态相近不易区分;在粪便、土壤和食品等不同标本/样品的直接涂布和增菌划线分离的加标试验中,mPDA和PCFA上的检出率均超过80%,明显高于PDA和TYCA。结论 mPDA和PCFA分离效果比原标准的PDA明显提高,建议在标准修订中增加此两种选择性分离培养基。

椰毒假单胞菌酵米面亚种荧光标记扩增片段长度多态性分型方法的建立

目的建立椰毒假单胞菌酵米面亚种荧光标记扩增片段长度多态性(FAFLP)分型方法,并对4株模式菌株和19株分离菌株进行分型。方法选用4种低频限制性内切酶(ApaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ)和2种高频限制性内切酶(MseⅠ和TaqⅠ)进行组合,对FAFLP预扩增和选择性扩增体系进行优化,用BioNumerics软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析,并与VITEK 2 GN生化结果和16S rDNA序列分析进行比较。结果 ApaⅠ-G/TaqⅠ-G组合将19株椰毒假单胞菌酵米面亚种分为7个群,菌株间最低相似度为80.85%,最高相似度为98.77%。PstⅠ-T/TaqⅠ-G组合将19株椰毒假单胞菌酵米面亚种分为10个群,菌株间最低相似度为48.68%,最高相似度为99.67%。两种FAFLP组合均能将菌株进行完全区分,而VITEK 2 GN和16S rDNA序列分析无法将菌株进行完全区分。结论 ApaⅠ-G/TaqⅠ-G组合与PstⅠ-T/TaqⅠ-G组合FAFLP对椰毒假单胞菌酵米面亚种具有足够的分辨率,本研究建立的FAFLP分型方法可应用于椰毒假单胞菌酵米面亚种的分子分型和溯源。