天蚕抗菌肽B基因的化学合成及克隆

用化学合成法,我们设计、合成了一个以植物偏爱的遗传密码子编码的天蚕抗菌肽B基因。通过把该基因与M13mp19噬菌体载体重组、克隆;转化大肠杆菌JM103,杂交检测和序列测定,得到二个与设计一致的克隆。

HBVC区基因克隆和PCR条件优化

目的建立PCR优化条件和方法,探讨HBVC区基因在乙型肝炎PCR检测中的应用价值,为荧光定量PCR检测HBV摸索条件。方法将HBV基因组导入DH5α大肠杆菌,SDS碱裂解法小量提取大肠杆菌阳性构建质粒DNA,设计合适引物对HBVC区基因进行PCR扩增,对PCR条件中的退火温度、Mg2+浓度进行了优化,并比较三种不同Taq DNA聚合酶的灵敏度。结果转化的大肠杆菌质粒DNA最佳退火温度为58℃,最佳Mg2+浓度为1.5mM,同时确定天源公司的Biostar Taq DNA聚合酶灵敏度最高,扩增到10-6。结论确立了HBVC区PCR的优化条件,将为后期进行荧光定量PCR检测HBV感染奠定基础以及为探索更有效的检测方法提供实验依据。

绵羊白细胞介素2基因的克隆与表达载体构建

从绵羊血中分离白细胞,提取绵羊白细胞RNA,利用RT-PCR、PCR扩增绵羊白细胞介素2(OvineIL-2)基因。将OvineIL-2PCR产物与TE载体定向连接,用SaLI和BamHI双酶切重组TE,利用低溶点胶回收500bp大小的片段;将其补平后与PPSD质粒连接,用EcoRI酶切鉴定,找出正向连接重组质粒。用BamHI酶切重组PPSD质粒,低熔点胶回收2500bp大小的片段;将其与经BamHI酶切去磷酸化的PME290表达质粒连接,筛选出阳性重组PME290,即为OvineIL-2基因表达载体。

枸骨法尼基焦磷酸合酶IcFPS2基因克隆与原核表达分析

目的 克隆枸骨Ilex cornuta三萜皂苷生物合成途径中关键酶法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,对其进行组织特异性表达分析,构建原核表达载体并进行重组蛋白诱导表达,探究其参与调控三萜皂苷生物合成的功能。方法 结合枸骨转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术从枸骨叶中扩增得到了IcFPS2基因的c DNA序列,对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量进一步分析其组织表达特异性,构建原核表达载体pET32a-IcFPS2,并转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。结果 IcFPS2基因长1259 bp,开放阅读框为1050 bp,编码350个氨基酸,其蛋白质相对分子质量和等电点分别为40 200、5.54。氨基酸序列比对分析表明枸骨与栀子、杜仲、甘草、绞股蓝、竹节参的FPS氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析显示,IcFPS2蛋白与西洋参、人参、竹节参FPS蛋白聚为一支,表明枸骨FPS蛋白可能与双子叶植物五加科FPS蛋白在功能上较为接近。实时荧光定量PCR分析表明,IcFPS2基因在根中的表达量最高,其次是叶,而后是雄花和茎,该基因在雌花中表达水平最低。原核表达分析结果显示,构建的IcFPS2-pET-32a载体能在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,SDS-PAGE结果显示,诱导的重组表达蛋白相对分子质量在45000左右,与预测的IcFPS2蛋白大小基本一致。结论 通过对IcFPS2基因的全长c DNA克隆与生物信息学分析、组织表达特异性分析和原核表达载体的构建,为后续进一步研究法尼基焦磷酸合酶基因在枸骨三萜皂苷生物合成途径的功能供科学依据。