腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。

腐败梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系试验

为了确定腐败梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系,将不同剂量的类毒素分别接种家兔和绵羊,免疫17日后测定血清中和效价,并用1MLD的毒素进行攻毒。测毒结果表明,1个家兔MLD的毒素含量为小鼠MLD的30倍,1个绵羊MLD的毒素含量为小鼠MLD的600倍。血清中和试验和免疫攻毒保护结果表明,类毒素含量与免疫效果在一定的范围内呈正相关,在家兔和绵羊上能提供保护的最小免疫剂量分别为100个小鼠MLD和300个小鼠MLD的类毒素。本试验结果为腐败梭菌疫苗的研制提供了重要的参考数据。

腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素的共表达及其免疫效力评价

为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 m L/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 m L;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准。结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础。

大肠杆菌表达腐败梭菌α毒素及其产物的生物学特性鉴定

为了制备大肠杆菌源的重组腐败梭菌α毒素并对其生物学特性鉴定。利用PCR扩增α毒素基因,构建重组表达质粒pET32a-csa,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,对产物的反应原性、溶血活性、细胞毒性、小鼠致死毒性、毒力和毒性中和等生物学特性鉴定。结果显示,重组α毒素主要表达形式为包涵体,产物能够与腐败梭菌抗毒素血清反应,不能使绵羊红细胞发生溶血,具有细胞毒性和小鼠致死毒性,毒力超过300 MLD/mL,而且这种毒性可以被抗毒素中和。结果表明,通过大肠杆菌原核表达可以制备具有一定生物活性的重组腐败梭菌α毒素。

羊快疫发病机制及防治

羊快疫(Braxy)是由腐败梭菌(Clostridium septicum)引起的一种急性、高度致死性传染病,腐败梭菌α毒素是其主要的致死毒素。因腐败梭菌会引起家畜恶性水肿,故曾被称为恶性水肿杆菌,对人类健康和畜牧业生产造成严重危害。目前,国内外对于腐败梭菌及其毒素的研究尚有空白,疾病的诊断和防控技术还存在不足。文章从羊快疫的发病机制及其防治措施等方面进行了综述,介绍了目前国内外对于此种疾病的研究进展并进行了展望。

腐败梭菌α毒素蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立绵羊腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法,将腐败梭菌α毒素基因进行密码子优化后,通过基因合成连接到pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-α。将重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)p LysS感受态细菌,用IPTG诱导重组α毒素蛋白表达并纯化表达蛋白,切除表达蛋白携带的GST标签后,得到重组腐败梭菌α毒素蛋白。以腐败梭菌α毒素蛋白为包被抗原,建立腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法。结果表明,腐败梭菌α毒素蛋白以200 ng/孔,绵羊血清稀释度为1∶200,封闭液为10 g/L BSA,家兔抗山羊HRP酶标二抗稀释度为1︰8000,避光显色20 min为最佳的ELISA条件。检测50份阴性血清,计算平均值(x^(-))、标准差(s),依据(x^(-)+2s)确定建立的腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法的阴阳性临界值为0.244。检测血清敏感度为1︰6400;批内、批间重复性试验结果显示,该方法的变异系数均小于10%;特异性试验结果显示,该方法与绵羊B型产气荚膜梭菌、C型产气荚膜梭菌、绵羊布鲁菌、鼠伤寒沙门菌及羊痘病毒阳性血清均无交叉反应。用建立的间接ELISA和商品化腐败梭菌α试剂盒分别检测100份临床血清样本,结果表明这2种方法的阳性符合率为94.87%,阴性符合率为81.97%,总符合率为87.00%。对三联四防疫苗免疫绵羊血清的检测结果表明,本方法的检测结果能够更好地反映出接种疫苗后免疫绵羊血清中抗α毒素抗体的消长情况。该检测方法具有很好的敏感性、重复性和特异性,适用于腐败梭菌感染临床血清样品的检测和腐败梭菌疫苗免疫效果的评价。

截短腐败梭菌α毒素的表达及其免疫原性评价

为了获得截短腐败梭菌α毒素并评价其毒性、反应原性和免疫原性,根据腐败梭菌α毒素的结构与功能,设计2对引物分别扩增含有穿孔活性区和受体结合区的α毒素基因csaN和csaC,克隆至pET-28a(+)质粒,构建截短α毒素表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导csaN和csaC表达,鉴定产物的反应原性和毒性,将经过诱导表达的工程菌灭活制成铝佐剂疫苗免疫家兔1次,通过血清中和试验和攻毒保护试验评价免疫效力,设立重组α全毒素rcsa免疫组作为阳性对照。结果显示,2个截短α毒素在大肠杆菌BL21(DE3)中均获得表达,产物能够与腐败梭菌抗毒素血清发生特异性反应,但失去了小鼠致死毒性。免疫家兔血清中和试验结果显示,csaN组血清的中和效价为1 MLD/0.1 mL,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015年版)》效力检验的最低标准,csaC组为0,rcsa组为8 MLD/0.1 mL;csaN和csaC组家兔用1 MLD毒素攻击均未获得保护,而rcsa组家兔4/4获得保护。结果表明,截短α毒素与全毒素相比,失去了毒性但保留了反应原性,仅含穿孔活性结构区的截短部分具有较弱的免疫原性。

重组腐败梭菌α毒素的生物活性及其灭活疫苗的免疫效果

为了研究重组腐败梭菌α毒素的生物活性及其灭活疫苗的免疫效果,采用PCR法扩增腐败梭菌α毒素基因,构建重组表达质粒pET28α-csa,转化E.coli BL21(DE3);对表达产物的细胞毒性、小鼠致死毒力和抗毒素中和试验等生物活性进行鉴定,并将其制成灭活疫苗免疫家兔和靶动物绵羊,通过攻毒素试验和血清中和试验与类毒素疫苗进行比较。结果显示,重组α毒素能够与腐败梭菌抗毒素血清反应,具有细胞毒性,小鼠致死毒力超过300 MLD/mL,其毒性可以被腐败梭菌抗毒素中和。制成灭活疫苗免疫家兔,随着免疫剂量的增加血清中和效价随之提高,0.25 mL/只(含重组α毒素0.11 mg)免疫即可使家兔获得100%保护,免疫效果优于类毒素疫苗;0.50 mL/只(含重组α毒素0.22 mg)免疫绵羊攻毒保护率为75%。结果表明,重组腐败梭菌α毒素具有很好的生物活性,所制成的灭活疫苗可以作为预防羊快疫的候选疫苗。