clpP基因缺陷对肺炎链球菌毒力表达降低的研究

目的探索clpP基因缺陷对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力的影响。方法用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpP基因,用PCR、Western blot鉴定缺陷菌株,通过RT-PCR分析自溶素(major autoly-sin A,lytA)、表面黏附A(pneumococcal surface adhesion A,psaA)、溶血素(pneumolysin,ply)和胆碱结合蛋白A(cholinebinding protein A,cbpA)的表达,并通过动物实验观察clpP基因缺陷株毒力改变情况。结果RT-PCR显示clpP缺陷株的4个毒力因子mRNA表达水平均低于野生菌,两者比较有统计学差异(P<0.05);小鼠毒力实验表明野生菌株半数致死时间为22h,而缺陷株半数致死时间为8d,两者比较有统计学差异(P<0.01);缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌株(P<0.05)。结论clpP基因缺陷使S.pn多种毒力因子表达减弱,毒力降低。

牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株的毒力和免疫保护力评价

为研究布鲁氏菌clpP基因与细菌毒力的关系,采用同源重组的方法,构建牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株,用巨噬细胞RAW264.7感染模型和小鼠感染模型评价clpP基因缺失株的毒力,同时测定该缺失株免疫小鼠后产生的免疫保护力。研究发现:牛种布鲁氏菌clpP基因缺失后,在细胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力显著降低;clpP基因缺失株感染小鼠后,不引起脾脏肿胀,并且在脾脏内的持续期短于A19疫苗株,说明该基因缺失株具有更高的安全性;使用clpP基因缺失株免疫小鼠后,该基因缺失株无法抵御牛种布鲁氏菌2308株和羊种布鲁氏菌M28株的感染。本研究为揭示布鲁氏菌致病机制和新型布病疫苗研发提供了参考。

铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株的构建

目的构建铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。方法分别以质粒pUCGM和铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板PCR扩增庆大霉素抗性基因(GM)和铜绿假单胞菌clpP基因及其3′、5′侧翼序列,将clpP基因及其3′、5′侧翼序列克隆至pMD19T载体,EcoRV切除clpP基因37bp^453bp片段后,引入庆大霉素抗性基因,构建重组质粒pCKR2;EcoRⅠ/HindⅢ双酶切重组质粒pCKR2,回收FclpP-GM-clpPR片段,与自杀质粒pEX18Tc连接,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pCKR3;将pCKR3质粒转化大肠埃希菌SM10,与铜绿假单胞菌PAO1双亲杂交,庆大霉素筛选得到铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。结果经酶切鉴定同源重组载体pCKR3构建正确;PCR和DNA测序鉴定铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株构建成功。结论本研究成功敲除了铜绿假单胞菌clpP基因,为进一步研究clpP基因的生物学功能奠定了基础。

htrA和clpP基因缺失对变异链球菌铁代谢的影响

目的探讨高温需要蛋白A(htrA)和酪蛋白裂解酶P(clpP)单基因缺失对变异链球菌铁代谢的影响。方法采用浊度法测定变异链球菌标准株、htrA缺陷株和clpP缺陷株在0.1、0.2及0.3mmol/L铁限制条件培养基中培养24h的吸光度(A)值,并测定加入外源性铁或标准株分别与2种缺陷株在0.3mmol/L铁限制培养基中混合培养24h后的A值。结果与标准株相比,htrA缺陷株在浓度0.3mmol/L时A值差异有统计学意义(P<0.01);clpP缺陷株在0.2mmol/L时A值差异即有统计学意义(P<0.05),并且其值随铁螯合剂浓度的增加而减小。加入FeSO4培养24h,htrA缺陷株与标准株A值差异无统计学意义(P>0.05);clpP缺陷株的A值低于标准株(1.002±0.014 vs 1.325±0.010,P<0.05)。与标准株按1∶1比例混合培养24h,htrA缺陷株与其单独生长时的A值的差异无统计学意义(P>0.05);clpP缺陷株的A值高于其单独培养时的A值(10.878±0.005 vs 0.664±0.006),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 htrA和clpP基因分别在一定程度上影响变异链球菌的铁代谢。

clpP基因对变异链球菌生长及氧化应激的影响

目的观察变异链球菌clpP基因缺陷株的生长特点;比较标准株与clpP基因缺陷株在氧化应激条件下的生长情况的差异。方法将两菌株分别培养在普通TPY液体培养基和含有H2O2终浓度0.0 005%的TPY培养基中,37℃微需氧条件下培养,从接种入培养基开始以2 h间隔采用酶联免疫检测仪在600 nm下测定各菌株的生长曲线并比较其生长情况的差异。结果①缺陷株在TPY液体培养基中生长时,生长周期发生改变,对数期峰值提前且此阶段生长速度较标准株快(P<0.05),而标准株的对数期峰值及稳定期A值均明显高于缺陷株(P<0.05);②标准株和缺陷株在含有H2O2的TPY液体培养基中生长时生长能力较无H2O2条件下明显降低(P<0.05)。结论 clpP基因的失活一定程度上导致变异链球菌生长能力和氧化应激能力的降低。

牙龈卟啉单胞菌clpP基因缺失株和回补株的构建和鉴定

目的构建并鉴定牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)W83的丝氨酸蛋白酶(caseinolytic protease,Clp)基因缺失株和回补株,为探索clpP基因在P.g致病过程中的作用和机制奠定基础。方法设计clpP基因的引物对,PCR扩增其上下游同源片段,克隆入质粒pUC18中,插入红霉素抗性基因ermB作为筛选标记,构建重组质粒,电转化入P.g W83构建缺失株;PCR扩增clpP基因片段与重组质粒pUC18-ΔclpP-ermB连接,电转化入P.g W83缺失株中构建回补株。采用PCR和酶切电泳鉴定序列的正确性,利用抗性培养基筛选高表达菌株。结果 clpP基因克隆成功并顺利导入质粒pUC18中,P.g W83的clpP基因缺失株和回补株构建成功,并能在体外稳定传代。结论本研究运用同源重组技术构建了P.g W83的clpP基因缺失株,并建立了以pUC18质粒为载体的clpP基因回补方法,为进一步研究clpP基因在P.g致病过程中的作用打下了基础。

CLPP基因新变异导致Perrault综合征的致病性鉴定

目的探讨一个耳聋合并智力障碍的中国家系的致病原因。方法收集该家系的临床表型、听力学及影像学等资料,应用耳聋基因靶向测序和Sanger测序法检测先证者目标基因的变异,并在家系其他成员中进行Sanger测序验证。结果该家系内患病个体男性患者表现为耳聋合并癫痫,运动功能障碍;女性患者表现为耳聋合并智力障碍,四肢肌无力,共济失调以及乳房发育差、月经初潮推迟等生殖系统发育不良表现。测序结果显示该家系中两名同胞患者检出CLPP基因c.661G>T和c.328delA复合杂合变异,先证者父亲检出CLPP基因c.661G>T杂合变异,先证者母亲检出CLPP基因c.328delA杂合变异,CLPP基因c.661G>T和c.328delA变异均为截短突变,此前未见报道,判定为新的致病性变异。结论CLPP基因c.661G>T和c.328delA复合杂合变异为导致该家系Perrault综合征3型的致病原因,该变异的检出丰富了CLPP基因的突变谱。

高温对体外唾液链球菌clpP基因表达的影响

目的:探讨高温对体外培养的唾液链球菌(S. salivarius) clp P基因表达的影响。方法:取10例人唾液样本在55℃培养,挑选生成的菌落进行分离培养、16S r DNA扩增及DNA序列测定,采用BLAST分析及构建系统发育树,鉴定得到S. salivarius临床株;采用PCR方法对S. salivarius ATCC 13419模式株(阳性对照)和获得的S. salivarius临床株进行clp P基因的片段克隆及序列分析,再用实时荧光定量PCR方法比较S. salivarius在37℃及55℃下培养2 h时的clp P基因相对表达水平。结果:在55℃培养下,10例唾液样本中仅有2例有少量菌落生成,最终经分离鉴定得到2株S. salivarius临床株,分别命名为HS_01和HS_02;利用PCR方法克隆S.salivarius ATCC 13419模式株、HS_01及HS_02菌株的clp P基因片段,经实时荧光定量PCR方法检测显示,3个S. salivarius菌株在55℃条件下clp P基因的相对表达水平高于37℃培养时,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论:高温刺激下获得的S. salivarius临床株的Clp P基因表达水平升高。

无标记的变异链球菌的clpP基因缺陷株的构建

目的 构建无标记的clpP基因缺陷的变异链球菌（简称变链菌）突变株.方法 设计引物PCR扩增大观霉素（Sp）抗性基因,使loxP位点位于Sp抗性基因的两侧,构建出大观霉素抗性基因盒（loxP-Sp-loxP）.将clpP基因克隆到pGEM-T-Easy TA载体后,双酶切以去除clpP基因的部分序列,并连入loxP-Sp-loxP,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pIB△clpP-Sp.将该载体线性化并电转变链菌标准株,大观霉素筛选得到clpP基因缺陷株.再以温敏质粒pCrePA电转缺陷株,Cre重组酶表达并删除选择标记基因,继而在限制性温度下培养以消除pCrePA,获得无标记的clpP基因缺陷株,并进行PCR及DNA测序鉴定.结果 PCR及DNA测序结果表明clpP基因内部分序列已被删除,且无Sp抗性基因,该部位只留有一个34 bp的loxP位点.结论 在变链菌中成功构建出无标记的clpP基因缺陷株,为进一步研究clpP基因的功能及其在变链菌致龋过程中的作用奠定了基础.

htrA、clpP基因缺失对变异链球菌耐酸性的影响

目的探讨htrA、clpP基因缺失对变异链球菌耐酸性的影响。方法变异链球菌标准株及htrA缺陷株、clpP缺陷株培养至对数中期分成两组,一组作为实验组进行5h预酸化处理(pH=5.5),一组作为对照组在普通乳酪消化胨酵母(TPY)培养液中处理5h,然后将两组菌株在致死性酸环境(pH=3.0)处理3h,每隔1h取菌液采用平板活菌计数法测定活菌数,计算得到生存率,统计学分析。结果 3h内,未经预酸化处理三种菌株生存率相比差异无统计学意义(P>0.05),预酸化处理后,与标准株相比htrA缺陷株和clpP缺陷株生存率都有下降(P<0.05),两种缺陷株相比生存率差异无统计学意义(P>0.05),预酸化处理的标准株和htrA缺陷株生存率均明显高于未经预酸化处理(P<0.05),预酸化处理对生存率的影响大于两种基因分别缺失(P<0.05)。结论与变异链球菌标准株相比,htrA缺陷株和clpP缺陷株耐酸能力有不同程度的下降。

利用Red重组系统敲除大肠杆菌菌株ClpP基因方法的研究

为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒pCP20去除氯霉素抗性基因。结果表明:成功敲除大肠杆菌菌株ClpP基因。

苏云金芽胞杆菌clpP基因缺失对碱刺激敏感性的影响

【目的】比较苏云金芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌在碱性培养条件下生长情况,明确clpP基因在碱刺激条件下的作用。【方法】采用同源重组技术敲除苏云金芽胞杆菌HD73菌株clpP基因,通过在不同pH下生长曲线的测定明确了clpP基因缺失突变体对碱性环境的敏感性,测定clpP基因的缺失对芽胞形成率、芽胞萌发效率和盐胁迫的影响。【结果】苏云金芽胞杆菌在碱刺激后,当培养基pH值为8.9-9.1时可以恢复生长,而枯草芽胞杆菌在pH值为8.2-8.4时可以恢复生长,说明苏云金芽胞杆菌对碱性环境适应能力更强,这有助于作为病原菌的Bt适应昆虫中肠的碱性环境。clpP基因缺失对芽胞形成率和萌发效率没有明显的影响。在将培养基中NaOH终浓度调节至30 mmol/L NaOH时,clpP基因缺失突变体的生长较出发菌株慢。说明ClpP在苏云金芽胞杆菌对碱性环境的适应过程中具有重要作用。

肺炎链球菌候选蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性

目的:评价酪蛋白裂解酶P(ClpP)作为候选疫苗的保守性和抗原性,分析在不同血清型肺炎链球菌(SPN)中的表达情况.方法:以TIGR4型SPN的ClpP基因序列设计引物,分别以12株不同血清型SPN的基因组DNA为模板,对ClpP基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增、胶回收产物与PMD-18克隆载体连接后进行测序,运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列及抗原性进行分析,并利用West-ernBlot方法检测12株不同血清型SPN的ClpP蛋白的表达情况.结果:12株不同血清型SPN的ClpP基因序列和Gen-Bank数据库对已公布的TIGR4型SPN的ClpP基因一致性>99.0%,推测的氨基酸序列一致性>99.5%.WesternBlot结果显示anti-ClpP多克隆抗体与12型SPN的菌体蛋白能够起交叉反应.结论:ClpP蛋白在不同型SPN之间同源性高,在不同型SPN菌株中均有表达.ClpP是一个具有前景的SPN候选蛋白疫苗因子.