西瓜ClPP2C3克隆及表达分析

【目的】蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C,PP2C)是动植物中均存在的一类蛋白磷酸酶,拟探究其在西瓜果实成熟过程中发挥的重要作用。【方法】通过逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)从栽培类型西瓜‘97103’中克隆ClPP2C3,并对其进行生物信息学、表达模式和亚细胞定位分析。【结果】西瓜ClPP2C3的cDNA序列长度为1317 bp,编码438个氨基酸,其分子量大小为47.81 kD,蛋白质等电点为5.12。ClPP2C3包含1个PP2C保守结构域,与负调控果实成熟的番茄SlPP2C3、草莓FaABI1具有较高的同源性。西瓜ClPP2C3在细胞核表达。ClPP2C3在含糖量高的栽培品种中表达量显著高于含糖量低的野生品种。栽培品种ClPP2C3的2kb片段长度启动子活性显著高于野生品种,而1kb片段长度启动子活性之间无显著差异。【结论】由1-2kb区间SNP导致的启动子活性差异对不同含糖量品种ClPP2C3表达量存在影响。

ClpP2蛋白失活对集胞藻PCC6803生长、光合作用和蛋白质组的影响

【背景】蛋白酶能够降解细胞中错误折叠或是无功能的蛋白,Clp家族蛋白就是一类重要的蛋白酶复合物。Clp蛋白酶复合物的水解核心是ClpP,集胞藻PCC6803中存在4种不同的ClpP蛋白,分别为ClpP1-ClpP4。作为重要的蛋白水解复合物的功能组分,目前对集胞藻ClpP的研究十分有限,对其生理功能与调控底物的研究甚少。【目的】选择集胞藻为研究对象探究ClpP2蛋白的功能,鉴定其潜在底物,为集胞藻ClpP2作用机制提供实验支撑。【方法】构建集胞藻ClpP2突变株(ΔClpP2),进行其生长实验和光合生理功能研究。通过标记定量蛋白质组学技术(isobaric tag for relative absolute quantitation,iTRAQ)鉴定ClpP2调控的靶标蛋白,生物信息学分析底物蛋白参与的代谢通路,最后利用平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)技术对部分定量数据进行验证。【结果】ΔClpP2可以在自然条件下光合自养生长至对数生长期,但高光或高温胁迫下则无法正常生长。相较于野生型,ΔClpP2有着显著降低的PSⅡ电子传递效率及PSⅠ环式电子传递活性。通过iTRAQ定量蛋白质组学手段,ΔClpP2相对于WT共鉴定到206个差异表达蛋白,其中131个上调、75个下调,为ClpP2蛋白酶提供了丰富的潜在底物库。基因本体论(gene ontology,GO)分析发现ClpP2主要参与各种物质的转运,其中ABC蛋白转运途径显著被富集。利用PRM技术对34个差异表达的蛋白进行了验证。【结论】ClpP2蛋白不是集胞藻生长所必需,但在高温或者高光胁迫下是必不可少的,其失活会降低集胞藻光合系统活性。ClpP2可能通过调控离子转运进而影响光合系统。ClpP2很可能与ClpX结合形成蛋白酶复合物。

结核分枝杆菌clpP2抗原表位预测与分析

目的预测结核分枝杆菌酪蛋白酶蛋白水解亚基单位2(clpP2)的抗原表位,为结核病疫苗、药物研制等提供新的靶点。方法以clpP2蛋白的氨基酸序列为基础,采用生物信息软件DNA Star预测二级结构;运用SWISS-MODEL在线软件进行同源建模;运用VaxiPred软件综合预测T细胞抗原表位,用ABCpred、COBEPro和BepiPredPred软件综合预测其B细胞抗原表位;采用DNA Star Protean、SignalP、TMHMM在线软件和NCBI数据库分析其免疫学相关信息。结果 clpP2蛋白结构丰富,含有较多潜在细胞毒性T细胞和辅助T细胞表位;也含有较多的B细胞线性和构象优势表位,这些区域亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高。结论 clpP2蛋白具有诱导免疫应答的潜能,可以作为结核监测、治疗、预防的新靶点。

结核分枝杆菌Rv2460c基因的克隆,表达及编码产物的免疫特性分析

目的:对结核分枝杆菌Rv2460c基因(编码Clp P2蛋白)进行克隆,表达,并评价其编码产物的免疫原性。方法:扩增结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)H37Rv的Rv2460c基因,构建重组质粒p ET32a(+)-Clp P2,用IPTG诱导表达,利用亲和层析法进行纯化。用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白Clp P2的表达和鉴定。用生物信息学对Mtb Clp P2的免疫原性分析和表位预测。酶联免疫吸附法(ELISA)测定兔和TB病人血清anti-Clp P2滴度。结果:重组Clp P2蛋白酶在大肠杆菌中以包涵体形式表达,经bandscan软件分析纯化蛋白的纯度为93%。生物信息学分析Mtb Clp P2蛋白具有多个优势B细胞表位和T细胞表位。ELISA法测定兔抗血清效价为1∶64 000;检测肺结核病人血清中anti-Clp P2抗体水平高于健康对照人群。结论:成功纯化了重组蛋白Clp P2和制备了特异性兔抗Clp P2多克隆抗体,实验和信息学均表明Mtb Clp P2蛋白酶有较强的免疫原性。