RNAi沉默Nrf2基因增强煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞的毒性作用

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Nrf2基因对煤焦沥青烟提取物(CTPE)致人支气管上皮细胞(BEAS-2B)发生恶性转化过程中的作用,为肺癌的发生机制提供线索。方法:应用RNAi技术建立Nrf2基因沉默的BEAS-2B细胞稳定表达株;设立二甲基亚砜(DMSO)阴性对照组、苯并(a)芘[B(a)P]阳性对照组、CTPE组、RNAi组;采用软琼脂克隆形成实验分析细胞恶变情况;采用RT-PCR法检测Nrf2和NQO1 mRNA的表达;Western blot法检测Nrf2和NQO1蛋白的表达。结果:20代以后,B(a)P组、CTPE组和RNAi组的克隆形成率高于DMSO组(P<0.001);而RNAi组的克隆形成率高于B(a)P组和CTPE组(P<0.001)。B(a)P组和CTPE组Nrf2 mRNA和蛋白表达水平均较DMSO组增加(P<0.001),B(a)P组、CTPE组和RNAi组NQO1 mRNA和蛋白水平均较DMSO组上调,RNAi组的表达量低于B(a)P组和CTPE组(P<0.001);诱导后(CTPE组)第10代、20代、30代细胞中Nrf2与NQO1的蛋白表达呈正相关(r=0.913,P<0.001)。结论:Nrf2可能通过上调NQO1的表达对抗CTPE对BEAS-2B细胞的毒性作用从而抑制细胞恶化;Nrf2和NQO1在BEAS-2B细胞癌前病变阶段已呈现较明显表达,这可能有助于接触CTPE高危人群罹患肺癌的预警及筛查。

煤焦沥青烟提取物对THP-1细胞炎性因子表达影响

目的探讨煤焦沥青烟提取物(CTPE)对人单核细胞株(THP-1)炎性因子表达的影响。方法用2μg/mL CTPE处理THP-1细胞24、48、72 h,并设立阴性对照组、二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组,real-time PCR检测各组细胞中白介素1β(IL-1β)、白介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养上清中TNF-α含量。结果染毒CTPE 24 h时,染毒组IL-1βmRNA表达水平为(2.22±0.33),均高于阴性对照组和溶剂对照组(P<0.05);染毒CTPE 72 h时,染毒组IL-8和TNF-αmRNA表达水平分别为(4.64±3.03)、(3.15±0.22),均高于阴性对照组和溶剂对照组(P<0.05);与对照组比较,染毒72 h时染毒组细胞培养上清中TNF-α含量[(538.44±53.88)pg/mL]升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CTPE刺激单核细胞后可使TNF-α、IL-1β、IL-8表达水平增加。

煤焦沥青烟提取物对人支气管上皮细胞的脂质过氧化作用

[目的]研究煤焦沥青烟提取物(CTPE)刺激人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的脂质过氧化作用。[方法]用不同浓度(0、1、3μg/mL)的CTPE刺激BEAS-2B细胞4 h后,流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平。刺激BEAS-2B细胞8 h后,用丙二醛(MDA)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)活力测定试剂盒分别检测细胞裂解液中的MDA含量和SOD活力。[结果]与对照组相比,CTPE(1、3μg/mL)作用细胞4 h后,ROS含量均显著升高(P<0.05)。1、3μg/mL CTPE刺激细胞8 h后,MDA含量均升高,SOD活力均明显降低(P<0.05);MDA/SOD值升高(P<0.05)。[结论]煤焦沥青烟提取物刺激BEAS-2B细胞后ROS水平和MDA含量增高,SOD活力降低,发生了脂质过氧化作用。

人单核细胞对煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞TRAF2 mRNA表达的影响

目的探讨人单核细胞(THP-1)对煤焦沥青烟提取物(CTPE)诱导BEAS-2B细胞肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)mRNA表达的影响。方法构建THP-1细胞和BEAS-2B细胞的共培养模型,用终浓度3μg/m L的CTPE处理共培养模型,细胞培养至第9代时加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)中和抗体和C-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂SP600125,继续培养至第15代(CC15),设立共培养模型CC15组、TNF-α中和抗体组、JNK激酶抑制剂SP600125组,同代培养的BEAS-2B细胞为对照组,用Real-time PCR方法检测各组细胞中TRAF2 mRNA的相对表达水平。结果与CC10组相比,TNF-α中和抗体对共培养细胞作用不同时间时TRAF2 mRNA的相对表达量均降低(P<0.001),作用48 h时TRAF2 mRNA相对表达水平达到最低(0.19±0.02)。SP600125抑制剂作用共培养细胞不同时间时c-Jun mRNA的相对表达水平与CC10组相比差异均有统计学意义(P<0.001),36 h组表达水平最低(0.03±0.02)。TNF-α中和抗体组和SP600125抑制剂组TRAF2 mRNA相对表达水平(分别为1.73±0.04和1.88±0.05)均高于对照组(1.07±0.06),低于CC15组(2.23±0.09),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 THP-1可通过TNF-α上调了CTPE诱导的BEAS-2B细胞中TRAF2 mRNA的表达水平,TRAF2和AP-1之间可能存在负反馈作用。