眼镜蛇神经毒素分离纯化及其经大鼠直肠给药吸收的实验研究

目的利用色谱技术从眼镜蛇粗毒中分离纯化神经毒素,探索神经毒素经大鼠直肠途径给药后的吸收情况和镇痛活性。方法通过CM Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱和Sephadex G-50凝胶过滤色谱两步法分离纯化神经毒素。采用免疫组织化学技术观察神经毒素在大鼠直肠组织中的分布。利用Shotgun质谱技术和数据库检测大鼠血浆神经毒素片段。利用HE染色观察神经毒素对大鼠直肠组织结构的影响。利用醋酸扭体法测定神经毒素直肠给药后镇痛活性。结果通过色谱分离纯化得到电泳纯的神经毒素。神经毒素直肠给药3 h后直肠黏膜组织内神经毒素分布明显,阳性面积比率、平均光密度值、H-SCORE值与对照组相比差异明显(P<0.01)。质谱检测到大鼠血浆中神经毒素有关片段。HE染色表明神经毒素对大鼠直肠组织没有损伤,组织结构无明显病理变化。醋酸扭体法测定小鼠直肠给药神经毒素3 h后扭体抑制率达50%,提示具有镇痛活性。结论眼镜蛇神经毒素可以通过直肠吸收入血并且发挥镇痛作用,为后续研究眼镜蛇神经毒素直肠给药制剂提供实验依据。

广西境内两种常见神经毒类毒蛇咬伤中毒的临床特点与院前急救策略分析

目的分析广西境内两种常见神经毒类毒蛇咬伤中毒的临床特点,总结其院前急救策略,为临床提供参考。方法选择2007—2012年在我科急诊抢救与住院的102例眼镜王蛇与银环蛇咬伤中毒患者,根据咬伤蛇类将患者分为眼镜王蛇组35例和银环蛇组67例,对比两组患者的院前急救措施、就诊时间、出现呼吸肌麻痹时间、伤情分级、临床表现、呼吸机治疗情况、预后情况及院外与院内死亡率等。结果两组患者的性别、年龄、院前急救措施及就诊时间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。眼镜王蛇组危重型患者所占比例高于银环蛇组(80.00%和58.21%,P=0.028)。两组患者均出现了全身症状,眼镜王蛇组局部肿痛发生率(8.57%和0,P=0.015)、多器官功能障碍综合征(MODS)发生率(20.00%和5.97%,P=0.030)高于银环蛇组,出现呼吸肌麻痹时间短于银环蛇组〔(3.8±2.2)h和(7.1±8.4)h,P=0.042〕。眼镜王蛇组治愈率低于银环蛇组(77.14%和95.52%),死亡率高于银环蛇组(22.86%和4.48%),且眼镜王蛇组院外死亡率高于银环蛇组(11.43%和1.49%,P=0.027)。结论相对于银环蛇,被眼镜王蛇咬伤患者病情更为凶险,出现呼吸肌麻痹的时间更短,MODS发生率及院外死亡率更高,医务工作者应充分认识呼吸机辅助呼吸治疗的关键性,加强神经毒类毒蛇咬伤院前急救策略的宣教。

江西眼镜蛇毒神经毒素的提纯及部分性质鉴定

采用CM SephadexG5 0和SP SephadexG5 0两次柱层析 ,从江西眼镜蛇毒中分离提纯得到电泳纯的神经毒素 ,它对大鼠膈神经膈肌标本及清醒家兔具有典型的箭毒样作用 ,小鼠sc的LD50 为 5 3μg/kg ,等电点为 pH8 8,相对分子质量为 6 80 0～ 70 0 0 。

眼镜蛇神经毒素粉末剂的鼻黏膜纤毛毒性考察

目的：考察浙江产眼镜蛇神经毒素鼻用粉末剂（神经毒素粉剂）的鼻黏膜纤毛毒性。方法：以在体蟾蜍上腭模型，观察神经毒素粉剂对鼻纤毛摆动的影响；运用组织病理学方法，在给于家兔神经毒素粉剂后1，3，5，7d时，取鼻中隔黏膜进行光学显微镜观察。结果：神经毒素粉剂抑制鼻纤毛摆动强度，但停止用药后8～9h纤毛摆动可完全恢复，且纤毛形态无明显改变；家兔给予神经毒素粉剂后1，3，5d，其鼻中隔黏膜与空白对照组差异无显著性。第7天，黏膜上皮松化，黏膜轻度充血，但基底膜完整。结论：神经毒素粉剂无急性不可逆性鼻黏膜纤毛毒性。

徐长卿对舟山眼镜蛇毒心脏毒素和神经毒素毒性的影响

目的 探讨徐长卿提取液对眼镜蛇毒心脏毒素 (cardiotoxin,CTX)和神经毒素 (neurotoxin,NT)毒性作用的影响。 方法 用心电监测方法观察徐长卿提取液腹腔注射对 CTX致小鼠心脏毒性的影响 ;以小鼠死亡率和存活时间为指标 ,观察徐长卿提取液对 NT所致小鼠急性毒性的影响。 结果 徐长卿提取液 10 g/ kg腹腔注射对 CTX致小鼠心脏的毒性有明显的减毒作用 ,它抑制 CTX致小鼠 ECG(胸导联 ) ST段偏移 (抬高 ) (P<0 .0 5 ) ,降低 CTX致小鼠心脏停搏 (CA )的发生率 ,延长房室传导阻滞发生的潜伏期 (P<0 .0 5 ) ;徐长卿提取液对 NT所致小鼠的急性毒性无明显影响 ,既不能降低死亡率 ,也不能明显延长小鼠存活时间。 结论 徐长卿提取液腹腔注射有对抗眼镜蛇毒 CTX的毒性的作用 ,而对眼镜蛇毒

眼镜蛇神经毒素急性毒性试验

目的：观察眼镜蛇毒神经毒素（科博肽注射液）的急性毒性,为药物的临床安全使用提供依据。方法：选取3个批次的眼镜蛇毒神经毒素（样品1、2、3）,通过预实验设计各样品组数和剂量,分别给每组小鼠一次性肌肉注射相应批次和剂量的眼镜蛇毒神经毒素,观察给药后14 d内各受试小鼠的反应、死亡情况及主要脏器有无明显病理改变;Bliss法计算出各样品的半数致死量（LD50）及其95%可信限。结果：小鼠肌肉注射眼镜蛇毒神经毒素注射液后,部分小鼠从出现右后肢（给药侧）跛行,逐渐发展至全身肌张力降低,出现呼吸减慢,最后死亡,部分小鼠症状持续约2~6 h后开始缓解并逐渐恢复正常,尸检结果显示各脏器肉眼观察均未见明显异常;3个批次的眼镜蛇毒神经毒素经LD50及其95%的可信限分别为：样品1 LD50为202.097μg/kg,95%的可信限为174.358~234.249μg/kg;样品2 LD50为146.425μg/kg,95%的可信限为132.904~161.322μg/kg;样品3 LD50为160.726μg/kg,95%的可信限为138.863~186.030μg/kg。结论：眼镜蛇毒神经毒素注射液具有一定急性毒性,且其毒性作用可能主要累及肌肉神经系统。

白藜芦醇二聚体与眼镜蛇神经毒素的作用机制

通过Discovery Studio软件模拟白藜芦醇不同结构二聚体与眼镜蛇神经毒素(NT)的相互作用,采用波长365nm的光诱导白藜芦醇二聚体的形成,通过紫外-可见光谱分析和荧光光谱分析得到不同白藜芦醇浓度和不同光照时间下NT的紫外-可见光谱和荧光光谱,并对结合能及作用参数进行了运算.结果表明:相比于单体,白藜芦醇二聚物对NT的结合能更大、作用更强;波长365nm的光照射白藜芦醇后,NT光谱发生了变化,紫外光吸收增强,吸收峰红移,荧光猝灭,有新发射峰生成;荧光猝灭速率常数为5.62×1012L/(mol·s),猝灭机制属于静态猝灭;白藜芦醇二聚物和NT的结合常数为5.12×105L/mol,结合位点数为1,结合距离为3.40nm,易发生非辐射能量转移;同步荧光光谱显示白藜芦醇二聚体可与NT的酪氨酸和色氨酸残基作用,羟基氢键导致其亲水性提高;白藜芦醇二聚体与NT的主要作用位点在色氨酸残基.

^(125)I标记眼睛蛇神经毒素透过家兔直肠吸收实验研究

目的 :建立测定家兔血浆中眼睛蛇神经毒素 ( Neurotoxins,Nt)的放射性核素 ( 1 2 5I)示踪法 ,观察冰茶栓中 Nt透直肠粘膜吸收情况。方法 :1 2 5I-Nt采用氯胺 T法标记 ,血浆中 Nt浓度采用同位素结合三氯醋酸 ( TCA)沉淀法测定。结果 :Nt浓度在5～ 5 0 0 ng/ml之间线性关系良好 ,相关系数 r=0 .9990 ,平均回收率 =86.8% ,RSD小于 1 0 % ,最小检测线为 3ng/ml。冰茶栓中 ,家兔按 0 .39mg/kg直肠给 1 2 5I-Nt后 ,能检测到 Nt在血浆中含量。结论 :放射性核素 ( 1 2 5I)示踪法可用于血浆中 Nt含量测定 ,冰茶栓中 Nt能透过直肠粘膜吸收。

眼镜蛇长链神经毒素镇痛效应及可能机制

目的探究眼镜蛇长链神经毒素(CBT)的镇痛作用及可能机制。方法采用在体细胞外记录方法记录慢性炎症痛模型大鼠脊髓背角神经元的痛诱发放电,分别对六组实验大鼠注射生理盐水(5μL)、CBT(20、40、80 ng/kg)、阿托品(2 mg/kg)、阿托品(2 mg/kg)+CBT(40 ng/kg),观察不同含量CBT对脊髓背角神经元痛诱发放电的影响,同时观察胆碱能受体拮抗剂阿托品能否翻转其镇痛效应。结果不同含量CBT均可以显著抑制慢性炎症痛大鼠脊髓背角神经元的痛诱发放电,各含量CBT组放电频率与生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且该效应可被阿托品所阻断,阿托品+CBT组在20、30、40、50、60 min放电频率与CBT(40 ng/kg)组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CBT具有显著的镇痛效应,该效应有一定的剂量依赖性,胆碱能受体系统参与了其镇痛过程。

福建产眼镜王蛇毒神经毒素的分离及活性测定

目的 从眼镜王蛇蛇毒中分离神经毒素 ,测定其活性和毒性。 方法 应用 CM- Sephadex C- 5 0离子交换色谱 ,阶段梯度洗脱分离粗毒 ;用 Sephadex G- 5 0凝胶过滤纯化组分 ;用大鼠体外膈神经 -膈肌标本鉴定分离组分对神经 -肌肉接头的作用性质 ;观察神经毒素对乙酰胆碱 (Ach)引起蛙体外腹直肌收缩的量效曲线的影响 ;以Meier法测定神经毒素对小鼠的半数致死量 (L D50 )。 结果 眼镜王蛇粗毒经阳离子交换色谱后获得 A～ N共 1 4个蛋白峰 ,经鉴定 E、F、G、H、I、K等 6个蛋白峰具有阻断神经 -肌肉接头传导的作用 ,被鉴定为神经毒素 ,约占粗毒的 4 8.3% ;通过凝胶过滤对 E、G和 K组分进行初步纯化 ;E、G和 K组分可使 Ach引起的蛙腹直肌收缩的量效曲线平行右移 ,它们与 N2 -胆碱受体 (N2 - Ach R)的解离常数 (KD)分别为 :1 4 5 .87,73.5 3和 2 0 .0 4 ng/ m L;E、G和 K组分小鼠静脉注射的 L D50 分别为 :0 .884 ,0 .74 9和 1 .5 8mg/ kg。 结论 眼镜王蛇粗毒经离子交换色谱获得 6个神经毒素组分 ,经鉴定 E、G和 K组分为 N2 - Ach

眼镜王蛇神经毒素CM—11^1H谱的计算机辅助谱峰自动归属

２ＤＮＭＲ谱的自动归属是核磁共振发展的一个方向，ＣＡＰＲＩ即是蛋白质１Ｈ谱的计算机辅助谱峰归属的一种程序。作者将其应用于眼镜王蛇神经毒素ＣＭ－１１１Ｈ谱的归属，讨论了ＣＡＰＲＩ的功能和特点以及运用在ＣＭ－１１后得到的分析结果。

眼镜蛇毒MP成分对离体豚鼠回肠的收缩作用及与磷脂酶A_2活性的关系

目的探讨温度和磷脂酶A2抑制剂甲基二十碳二烯酸(DEDA)对眼镜蛇毒MP成分收缩离体豚鼠回肠作用的影响,阐明MP成分的药理作用是否依赖其磷脂酶A2(PLA2)活性。方法利用卵磷脂水解法测定在27℃和37℃下MP成分的PLA2活性;分别测定在27℃和37℃下MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠纵行肌作用强度并比较;将豚鼠回肠纵行肌标本在浴槽中预先5 min加入PLA2抑制剂DEDA 100μmol·L-1,再测定MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠纵行肌的作用强度,分别观察DEDA对MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠纵行肌作用强度的差异。结果 MP成分在27℃下水解卵磷脂的酶活性仅为37℃时的55%,具有显著性差异(P<0.01)。离体实验显示,27℃和37℃组间MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠的作用强度均不存在明显差异。与对照组相比,DEDA干预组MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠的作用强度均无明显差异。结论 MP对豚鼠回肠纵行肌的收缩作用与其PLA2活性不存在直接相关。

红光响应眼镜蛇神经毒素PEG-PLGA纳米囊的制备与表征

以聚乙二醇-聚乳酸-聚乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)为囊材,添加脱镁叶绿酸作为光敏剂,采用复乳法制备了光响应的眼镜蛇神经毒素纳米囊。以纳米囊的包封率、载药量和粒径为指标,采用单因素法对纳米囊的制备条件进行优化;以差示量热扫描分析其热流变性能,并以累积释药量研究其光控释行为。优化的PEGPLGA、眼镜蛇神经毒素及光敏剂脱镁叶绿酸质量配比为40∶12.5∶1,获得的纳米囊包封率为72.3%±3.6%,载药量为15.1%±1.3%,平均粒径为(862±23)nm,电位为(-46.5±3.8)m V,呈紧密球形,光敏剂分布在囊壳;在650 nm半导体激光照射30 min,体外释放明显加快。该纳米囊在不光照时具有增强药物稳定和缓释作用,而红光可促进药物释放,因而可实现光控靶向。

中华眼镜蛇α-神经毒的纯化及其在烟碱型乙酰胆碱受体纯化上的应用

目的从中华眼镜蛇粗毒中分离纯化其α-神经毒组分,并将此α-神经毒作为亲和层析的配基纯化烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)。方法采用凝胶过滤层析、阳离子交换层析逐步分离纯化中华眼镜蛇粗毒,通过125I-α-银环蛇毒素(αBtx)-nAChR结合抑制实验检测蛋白活性,SDS-PAGE检测蛋白的相对分子质量和纯度;亲和层析纯化nAChR,放射免疫沉淀法测nAChR活性。结果从5g中华眼镜蛇粗毒中共纯化得到约20mg眼镜蛇α-神经毒,该眼镜蛇α-神经毒有一定的125I-αBtx-nAChR结合抑制活性,其半数抑制浓度(IC50)约为αBtx的28倍。以纯化的α-神经毒制备的亲和介质,可吸附大鼠骨骼肌肌膜提取物中约84%的125I-αBtx结合活性,且此活性可以被0.2mol/L卡巴胆碱洗脱。结论用简单的液相色谱方法可从中华眼镜蛇毒中分离纯化α-神经毒,并且可以以其为配体从大鼠骨骼肌中纯化nAChR。

眼镜蛇属(Naja)毒液的主要功能组分研究进展

眼镜蛇属(Naja)的毒蛇常危害人类健康,其毒是一种混合毒素,主要成分为蛋白质、活性肽、酶。本文主要对眼镜蛇属蛇毒主要功能组分及其理化性质、药理活性与临床应用前景进行综述。

眼镜蛇毒神经毒素的^(125)Ⅰ标记及其在大鼠体内的分布

目的用氯胺T法标记眼镜蛇神经毒素(Neurotoxin,NTX),观察其在大鼠体内的分布。方法实验组和对照组的大鼠分别单次静脉注射125I-NTX50μg.kg-1和相同剂量的Na125I与NTX的临时混合液,于给药后30min和2h分两批处死,取各脏器组织样本称重并计算每g组织的cpm。用组织与血液的脉冲比值作为放射性相对掺入量的标准,用实验组(e)和对照组(c)相对放射性掺入量的比值(e/c)作为判断125I-NTX在大鼠各脏器组织分布多少的依据。结果大鼠静脉给125I-NTX50μg.kg-1后30min,分布最多的是肾脏,每g组织放射性达44cpm,为对照组的11倍。膀胱及尿、肺、肠及内容物、肾上腺亦有较高分布。给药后2h,分布最多的仍是肾脏,但比0.5h时减少一半左右。结论NTX主要分布在肾脏,肾脏以外的实质性脏器分布均较少,脑中分布最低。

眼镜蛇神经毒素大鼠不同脑区给药的镇痛作用研究

目的研究眼镜蛇神经毒素不同脑区给药的镇痛作用。方法大鼠30只分为对照组、中脑导水管组、第三脑室组、下丘脑组和尾状核组,对照组注射生理盐水组,第三脑室组注射10μL神经毒素,其他组注射0.5μL神经毒素,采用热水浴甩尾法测定痛阈。结果与对照组相比,其他组大鼠痛阈显著提高(P<0.01)。结论眼镜蛇神经毒素具有很强的中枢性镇痛作用,下丘脑部位注射效果最强。

眼镜蛇神经毒素的规模化制备及其镇痛作用的研究

目的建立一种快速、规模化制备眼镜蛇毒神经毒素的方法。方法采用CM-sephadex C-25和CM-sepharose fastflow离子交换柱层析纯化经初步处理的眼镜蛇毒;SDS-PAGE和HPLC检测产物的纯度;离体蛙心和红细胞溶血试验检查产物的心脏毒性和溶血性;小白鼠热板模型、醋酸扭体模型和大白鼠电刺激嘶叫模型评价产物的镇痛作用。结果制备的产物可达到电泳纯和HPLC单一峰,无心脏毒性和溶血活性,镇痛作用强,但起效慢。结论所用工艺适合眼镜蛇毒神经毒素工业化制备的需要。

眼镜蛇毒中神经再生因子和神经毒素的分离

本研究采用Sephadex G-100柱层析,用中性Tris-HCl缓冲液洗脱,分离眼镜蛇全毒.结果不仅有效地分离出神经再生因子和神经毒素,而且保持了各自的生物活性.

眼镜王蛇神经毒素的提纯及其性质的研究

本文用SP-SephadexC-25柱层析法分离广西眼镜王蛇蛇毒,得到19个组分,其中7个组分有毒性。对毒性较强,含量较高的4个毒性组分(即神经毒素Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅹ)用SephadexG-50凝胶过滤法进行纯化,并对神蛇经毒素Ⅶ和Ⅹ用CM-SephadexC-50柱层析法做了进一步纯化。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定,这4个神经毒素均为单一条带。用SDS-PAGE法测得神经毒素Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅹ的分子量分别为7800,6700,8400和8000,并用它们进行了小鸡颈二腹肌神经—肌肉接头传递的阻遏试验,结果表明这4个神经毒素均有阻遏神经—肌肉接头传递的作用,而且阻遇作用基本不可逆,属于突触后神经毒素。