眼镜蛇细胞毒素致昆明小鼠局部皮肤坏死模型的构建

目的通过皮内注射中华眼镜蛇细胞毒素(CTX)建立中华眼镜蛇咬伤皮肤坏死小鼠模型。方法通过凝胶层析+离子层析从中华眼镜蛇粗毒中分离出眼镜蛇细胞毒素(CTX-X)。取30只小鼠随机分为10组:生理盐水组、10μg粗毒组、20μg粗毒组、25μg粗毒组、10μg CTX-X组、20μg CTX-X组、30μg CTX-X组、40μg CTX-X组、50μg CTX-X组、60μg CTX-X组,每组3只。注毒72 h后观察小鼠注射部位皮肤坏死直径及病理变化。结果(1)中华眼镜蛇粗毒通过Sephadex G-50凝胶层析分离获得2个蛋白峰(F1、F2),将CTX-X所在的F2峰经过CM Sepharose TM CL-6B阳离子交换柱色谱分离获得F1、F2、F3、F44个峰,通过小鼠体内实验及SDS-PAGE确定F4峰分离的CTX-X具有活性且达到电泳纯。(2)CTX-X组小鼠的皮内坏死直径随着CTX-X剂量增加而增大,51.21μg CTX-X组的小鼠皮内坏死直径均值达到5 mm。粗毒组小鼠随着皮内注射粗毒剂量的增加,小鼠72 h内的死亡率增高,当皮内注射粗毒剂量<25μg时,注毒72 h后处死并解剖小鼠,注射部位未观察到皮肤坏死情况;当皮内注射粗毒剂量≥25μg时,所有小鼠在注毒后3 h内死亡,且皮内注射部位未见明显坏死。结论应用Sephadex G-50凝胶过滤+CM Sepharose TM CL-6B阳离子交换分离所得的CTX-X,于小鼠背部皮内注射可成功构建中华眼镜蛇CTX-X致局部皮肤坏死的动物模型,该模型稳定性高且具备良好的可复制性。

眼镜蛇毒细胞毒素缓释微球瘤内注射对裸鼠人肝癌皮下移植瘤的影响

目的:评价眼镜蛇毒细胞毒素(cytotoxin,CTX)-聚乳酸-羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)微球经皮瘤内注射治疗裸鼠肝癌的安全性和有效性。方法:采用甲基噻唑基四唑法检测分离纯化得到的眼镜蛇毒CTX体外细胞毒活性,复乳-溶剂挥发法制备眼镜蛇毒CTX-PLGA缓释做球。40只BALB/c裸小鼠皮下接种人肝癌细胞系BEL-7404细胞建立裸鼠皮下移植瘤肝癌模型,分为生理盐水组、空白微球组、游离CTX组和CTX-PLGA微球组。瘤内注射相应药物,治疗后每周用高频超声观察肿瘤内部回声和血流情况;治疗后第26天,剥离肿瘤称取质量并计算抑瘤率;取肿瘤组织和心、肝、肾等重要脏器,观察其病理学改变。结果:眼镜蛇毒CTX对体外培养的人肝癌:BEL-7404细胞具有较强的毒性作用。眼镜蛇毒CTX-PLGA缓释微球粒径约(34.45±9.85)μm,具有较高的包封率和较好的缓释效果。瘤体内一次性注射眼镜蛇毒CTX-PLGA微球后,肿瘤体积增长缓慢,抑瘤率达52.36%;光学显徽镜观察显示肿瘤组织大部分坏死,但心、肝、肾等重要脏器在形态学上无明显改变。结论:眼镜蛇毒CTX-PLGA微球瘤内注射可抑制裸鼠肝癌的生长,且具有较高的安全性。

眼镜蛇毒细胞毒素对人肝癌细胞增殖抑制活性及作用机制的研究

目的研究眼镜蛇毒细胞毒素(CTX)在体外诱导人肝癌BEL-7404细胞凋亡作用及其可能机制。方法不同浓度CTX作用于人肝癌BEL-7404细胞,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测肿瘤细胞增殖情况;TUNEL法和透射电镜观察检测肿瘤细胞凋亡;并对caspase-3、-9活性、细胞色素C分布变化进行检测。结果眼镜蛇毒细胞毒素对人肝癌BEL-7404细胞具有明显的抑制增殖作用,12、24和48 h的IC50分别为2.56、1.94和1.35 mg·L-1,TUNEL法和透射电镜均观察到肿瘤细胞的凋亡;caspase-3,-9酶活性增高,Western blot检测到caspase-3,-9酶的表达增强,线粒体内Cytochrome C表达减少,而细胞质内Cytochrome C表达增强。结论 CTX首先通过线粒体细胞色素C释放到细胞质内,进一步诱导效应性caspase-3,-9酶激活,可能是其诱导人肝癌细胞凋亡而产生抗肿瘤作用的机制之一。

福建产舟山眼镜蛇毒细胞毒素的快速分离纯化及鉴定

目的 从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素 (CTX) ,并鉴定其理化性质。 方法 采用 SP- SephadexC- 2 5阳离子交换色谱及 Sephasil Peptide C1 8反相高效液相色谱法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化 CTX,SDS- PAGE(Tris- Tricine系统 )鉴定纯度 ,Edman降解法测定 N端氨基酸序列。 结果 粗毒经阳离子交换色谱 ,得到 1 4个蛋白峰 ,其中第 ～ 峰具 CTX活性 ;再分别经反相色谱纯化 ,得到 4个 CTX,总得率为 32 .4 8% ;SDS- PAGE显示为均一蛋白 ,分子量依次为 :7.2 8,7.33,7.2 4和 7.38k D;测定它们 N端 2 0个氨基酸序列。 结论 采用阳离子交换和反相高效液相色谱可快速、高效地从眼镜蛇毒中获得 4个

眼镜蛇毒细胞毒素的分离、纯化及其抗癌活性

目的：研究眼镜蛇毒细胞毒素的抗癌活性。方法：应用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００和 ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ柱层析，从眼镜蛇毒中分离、纯化细胞毒素组分，用ＭＴＴ法测定该组分对体外培养的人癌细胞的细胞毒性作用。结果：眼镜蛇毒细胞毒素对人癌细胞ＳＧＣ－７９０１、Ｂｅｌ－７４０２、Ｋ５６２和Ｕ９３７的抑制作用呈良好的量效关系，半数抑制浓度分别为 ４．１０、 ２． ０８、 ０． ２９和 ０．１７ μｇ／ｍｌ。结论：眼镜蛇毒细胞毒素对体外培养的人癌细胞有很强的杀伤作用。

舟山眼镜蛇毒细胞毒素-Ⅻ的抗肿瘤作用

目的 了解舟山眼镜蛇毒细胞毒素 - (CTX- )的抗肿瘤作用。 方法 应用磺胺邻二甲氧嘧啶(SRB)法观察不同浓度 CTX- 对人肝癌 Bel74 0 4细胞和人早幼粒白血病 HL - 6 0细胞的生长抑制作用。观察CTX- 0 .4 ,0 .2 ,0 .1mg/ kg腹腔注射对 U 14荷瘤小鼠瘤块质量的影响并计算抑瘤率 ;CTX- 0 .4和 0 .2 m g/kg静脉注射对艾氏腹水癌 (EAC)小鼠腹水形成的影响并计算腹水减少率。 结果 CTX- 可明显抑制人肝癌Bel74 0 4细胞和人早幼粒白血病 HL - 6 0细胞的生长 ,其 IC50 分别为 (1.12± 0 .13)和 (1.6 1± 0 .18)μg/ m L。 CTX- 0 .4 ,0 .2和 0 .1m g/ kg腹腔注射× 10 d,对宫颈癌 U14抑瘤率分别为 30 .5 0 % (P<0 .0 1) ,19.0 2 % (P<0 .0 5 )和12 .0 8% (P>0 .0 5 ) ;CTX- 0 .4和 0 .2 mg/ kg静脉注射× 3d对 EAC小鼠腹水形成减少率分别为 2 5 .5 % (P<0 .0 5 )和 14 .5 % (P>0 .0 5 )。 结论 舟山眼镜蛇毒细胞毒素 - 具有明显的抗肿瘤作用。

眼镜蛇毒细胞毒素在体外对人癌细胞的毒性作用(MTT法)

目的测定眼镜蛇毒细胞毒素（ＣＶ－ＣＴＸ）对人癌细胞株的细胞抑制作用，以期能简便准确地反映其抗癌活性。方法应用溴化二苯四偶氮盐（ＭＴＴ）法测定在ＣＶ－ＣＴＸ作用下体外培养的人胃癌细胞株（ＳＧＣ－７９０１）和人肝癌细胞株（ＳＭＣ）的存活情况和其量效关系。结果（１）ＳＭＣ、ＳＧＣ－７９０１的活细胞数与其分解ＭＴＴ的量成正线性关系。（２）ＣＶ－ＣＴＸ对ＳＭＣ、ＳＧＣ－７９０１癌细胞株的细胞抑制作用呈良好的量效关系，ＩＣ５０分别为２．４５和１．２４μｇ／ｍｌ。结论（１）用ＭＴＴ法测定癌细胞的增殖和衰减是可靠的。（２）应用ＭＴＴ法证实ＣＶ－ＣＴＸ对体外培养的人癌细胞的杀伤程度可作为其抗癌活性指标。

广西眼镜蛇毒细胞毒素-1对人肝星状细胞LX2的选择性抑制作用

肝纤维化是肝硬化、肝癌和肝功能衰竭的共同病理基础和必经阶段,特征是肝内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是合成ECM的关键细胞,因此抑制其增殖并诱导其凋亡是抗肝纤维化的关键[1]。细胞毒素(cytotoxin,CTX)是眼镜蛇毒的主要活性成分,生物活性多样,对多种细胞均具有细胞毒性[2],在抗肿瘤研究中具有广阔的应用前景[3]。

舟山眼镜蛇毒细胞毒素-F对人鼻咽癌细胞和乳鼠心肌细胞的抑制作用

目的 观察舟山眼镜蛇毒细胞毒素 - F(CTX- F)对人鼻咽癌细胞 (CNE)和乳鼠心肌细胞的抑制作用 ,了解 CTX- F对人癌细胞株的选择性抑制作用 ,并初步探讨其作用机制。 方法 以磺胺邻二甲氧嘧啶法观察CTX- F0 .6 2 5 ,1 .2 5 ,2 .5 ,5和 1 0 μg/ m L 对体外培养 CNE和乳鼠心肌细胞的杀伤作用及作用的量效关系 ,同时观察 CTX- F作用 0 .5 ,1 ,2 ,4和 8h的时效关系 ,并比较 CTX- F对上述两种细胞作用的差异 ;采用透射电镜观察CTX- F对 CNE细胞形态的影响。 结果 CTX- F在 0 .6 2 5 μg/ m L 作用 0 .5 h时即可抑制 CNE细胞的生长 ,生长抑制率约为 7% ,1 0 μg/ m L 作用 0 .5 h,生长抑制率即可达 70 .3% ,作用存在明显的剂量依赖性 ,其 IC50 (μg/ m L)为1 .5 2。CTX- F作用 0 .5 h对 CNE细胞的 IC50 为 3.83,8h为 1 .5 3,有明显的时效关系。CTX- F乳鼠心肌细胞也有破坏作用 ,但敏感性较低 ,IC50 为 5 .92 ,约为 CNE细胞的 4倍。CNE细胞经 CTX- F(0 .6 2 5 μg/ m L)作用 0 .5 h后 ,电镜下可见到细胞核内染色质边集或固缩成团聚集在细胞的一侧 ,时间延长 ,可见细胞死亡。 结论 舟山眼镜蛇毒CTX- F对 CNE细胞有剂量和时间依赖性杀伤作用 ,其敏感性高于乳鼠心肌细胞。

眼镜蛇毒细胞毒素类免疫毒素研究进展

眼镜蛇毒细胞毒素类免疫毒素是将从眼镜蛇毒中分离纯化的细胞毒素与抗体或细胞因子偶联而得到的一类新型导向药物,它以抗体或细胞因子特异识别并结合靶细胞,通过细胞毒素破坏细胞膜而引起细胞死亡。由于细胞毒素类免疫毒素能高效、特异地杀伤靶细胞,因此选择眼镜蛇毒细胞毒素用于肿瘤导向治疗将是一条很有希望的途径。

眼镜蛇毒细胞毒素的抗肿瘤作用

目的 研究眼镜蛇毒细胞毒素（ Ｃ Ｖ Ｃ Ｔ Ｘ）的体内抗肿瘤作用。方法 小鼠皮下、腹腔接种 Ｓ１８０ 、 Ｅ Ａ Ｃ后， 于接种部位注射不同剂量的 Ｃ Ｖ Ｃ Ｔ Ｘ， 每天 １ 次， 连续１０ 天， 观察瘤重抑制率和生命延长率。结果 适当剂量（０２～０８ｍ ｇ／ｋｇ） 的 Ｃ Ｖ Ｃ Ｔ Ｘ 能明显抑制肿瘤的生长 （ Ｐ＜ ００１），小鼠的存活时间明显延长（ Ｐ ＜ ００１）。结论 Ｃ Ｖ Ｃ Ｔ Ｘ 在小鼠体内对 Ｓ１８０ 、 Ｅ Ａ Ｃ有明显地抗肿瘤作用。

广西眼镜蛇毒细胞毒素对人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞的抑制作用研究

目的 :研究广西眼镜蛇毒细胞毒素对体外培养的人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞株的抑制作用。方法 :通过 Sephadex G- 5 0 ,CM- Sepharose CL- 6 B柱层析从广西眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素 ,应用四氮唑蓝 (MTT)法测定其对人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞株的体外细胞毒作用及其量效关系 ,并与粗毒的抑瘤作用进行比较。结果 :从广西眼镜蛇毒中分离到一种细胞毒素 (CTXCM- 5 ) ,其对体外培养的人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞株的抑制作用呈明显的剂量依赖关系 ,抑制率随剂量增加而呈迅速上升的趋势 ,其作用 2 4h的 IC50 分别为 1.0 5 ,1.30 m g/L,其与粗毒相比 ,抑瘤作用更为显著。结论

MTT法测定眼镜蛇毒细胞毒素的抗癌活性

目的测定眼镜蛇毒细胞毒素（Ｃｏｂｒａｖｅｎｏｍｃｙｔｏｔｏｘｉｎ，ＣＶ－ＣＴＸ）对体外培养的人癌细胞的杀伤作用。方法溴化二苯四偶氮盐（ＭＴＴ）比色法。结果ＣＶ－ＣＴＸ对ＳＧＣ－７９０１，Ｂｅｌ－７４０２，Ｋ５６２和Ｕ９３７４种人癌细胞有很强的杀伤作用，量效关系明显，ＩＣ５０分别为４．１０，２．０８，０．２９和０．１７μｇ／ｍｌ。结论ＭＴＴ法检测ＣＶ－ＣＴＸ的抗癌活性，操作简便、快速和准确。

广西眼镜蛇毒细胞毒素-2的分离纯化及其对大鼠肝星状细胞HSC-T6的作用

目的通过层析法从广西眼镜蛇毒中分离得到电泳纯的细胞毒素-2(CTX-2),探索CTX-2对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用。方法采用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析、Spehadex G-50凝胶层析和Macro-prep High S阳离子交换层析结合的方法分离眼镜蛇毒粗毒;经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度;NanoLC-ESI-MS/MS质谱方法鉴定其组分并测定分子量;CCK-8法检测CTX-2对HSC-T6的增殖抑制作用,确定其最小有效浓度。结果眼镜蛇毒粗毒经分离纯化获得电泳纯的CTX-2,其分子量约为9.548 kD;不同浓度CTX-2作用于HSC-T6细胞24 h后,其增殖抑制作用随浓度增加而增大,呈量效关系,抑制增殖的最小有效浓度为8 mg/L,IC_(50)为11.52 mg/L。结论广西眼镜蛇毒粗毒经三步分离法得到电泳纯且具有高生物活性的CTX-2;广西眼镜蛇毒CTX-2可抑制HSC-T6细胞增殖,抑制作用呈量效关系。

眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化及其对HSC-T6细胞的作用

为了得到高纯度眼镜蛇毒细胞毒素-4N,探索眼镜蛇毒中细胞毒素-4N(cytototxin-4N,CTX-4N)对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC-T6)的增殖抑制作用。本研究采用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱结合的方法对眼镜蛇毒蛋白进行分离纯化。在每一步分离纯化过程中,采用CCK-8法检测各蛋白峰组分对HSC-T6细胞的增殖抑制作用活性,收集增殖抑制作用最强的CTX-4N峰。经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度,Nano-LC-ESI-MS/MS质谱方法鉴定其组分,Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂检测CTX-4N对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用,从而确定其药理作用。经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化后得到一个电泳纯度的蛋白,蛋白质谱鉴定为CTX-4N,分子量约为9.605 k D。不同浓度的CTX-4N作用HSC-T6细胞24 h后,随着其浓度的增大对HSC-T6细胞增殖抑制作用越强,呈剂量-效应关系,IC_(50)为(12.836±0.045)μg/m L。因此,本研究建立一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化方法,并确定了其对HSC-T6细胞的增殖抑制的药理作用随浓度的增加而增强,为进一步研究其药理作用提供一定的理论依据。

厚朴酚抑制小鼠乳腺上皮细胞炎症反应及其机制

中药抗炎治疗成为治疗乳腺炎的有效方法。厚朴酚(Magnolol)是从厚朴树皮中提取的一种多酚联萘化合物,已被证明具有潜在的抗炎活性。本研究旨在探讨厚朴酚对脂多糖(LPS)诱导的小鼠乳腺炎模型体内炎症的保护作用及其对脂多糖(LPS)刺激的小鼠乳腺上皮细胞(MMECs)的保护作用机制。使用组织病理学和髓过氧化物酶(MPO)测定组织损伤程度。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测促炎细胞因子的表达。Western blotting检测核因子-κB(NF-κB)、抑制性κB(IκBα)蛋白、p38、细胞外信号调节激酶、c-Jun氨基末端激酶的表达。结果表明,厚朴酚在体内和体外均能明显抑制脂多糖诱导的TNF-α、IL-6和IL-1β的产生。厚朴酚可降低LPS刺激的内皮细胞I-κBα、p65、p38、ERK和JNK的磷酸化水平。在体内实验中,还观察到厚朴酚对小鼠乳房炎组织的损伤作用。这些结果表明,厚朴酚通过抑制NF-κB/丝裂原活化蛋白激酶信号系统而减轻LPS刺激的炎症反应。说明厚朴酚可能是一种治疗乳腺炎的药物。

^(131)I-眼镜蛇毒细胞毒素14在大鼠体内的分布

用^(131)I按氯胺T法标记眼镜蛇毒细胞毒素14,观察其在大鼠体内的分布,静脉给药后0.5h,分布最多的是肾,每mg组织放射性达5979dpm,为对照组的14倍,肝、脾、胰、肾上腺亦有较高分布,给药后2h,脑组织亦见分布,其每mg组织放射性为50dpm,是对照组的3倍。