银杏叶提取物对放射性损伤耳蜗毛细胞株HEI-OC1增殖、凋亡及Survivin、Bax表达的影响

目的探讨银杏叶提取物(EGB761)对放射性损伤耳蜗毛细胞株HEI-OC1增殖、凋亡及细胞存活素(Survivin)、Bcl-2家族前凋亡蛋白(Bax)表达的影响。方法体外培养耳蜗毛细胞株HEI-OC1,设置正常对照组、放射性损伤组及10 mg/L、20 mg/L、50mg/L、100 mg/L EGB761干预组,除正常对照组外其他组均选择对数生长期HEI-OC1细胞进行照射,建立放射性损伤模型,之后各干预组分别给予相应浓度EGB761进行干预。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测各组HEI-OC1细胞增殖能力,利用流式细胞仪(FCM)检测各组HEI-OC1细胞凋亡情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRTPCR)检测各组细胞Survivin、Bax表达水平。结果 MTT结果显示,与正常对照组比较,放射性损伤组HEI-OC1细胞增殖能力明显下降(P <0. 05);与放射性损伤组比较,EGB761干预组HEI-OC1细胞增殖能力明显上升(P <0. 05),且呈一定剂量依赖性。FCM结果显示,与正常对照组比较,放射性损伤组HEIOC1细胞凋亡率明显增加(P <0. 05);与放射性损伤组比较,EGB761干预组HEI-OC1细胞凋亡率明显降低(P <0. 05),且呈一定剂量依赖性。qRT-PCR结果显示,与正常对照组比较,放射性损伤组HEI-OC1细胞中Survivin水平明显下降(P <0. 05),Bax水平明显升高(P <0. 05);与放射性损伤组比较,EGB761干预组HEI-OC1细胞中Survivin水平明显升高(P <0. 05),Bax水平明显下降(P <0. 05),且呈一定剂量依赖性。结论 EGB761可明显促进HEI-OC1细胞增殖,抑制HEI-OC1细胞凋亡。其作用机制可能为上调凋亡抑制基因Survivin表达及下调凋亡促进基因Bax表达。

1-苯基2-硫脲通过p53调控自噬活性来保护斑马鱼神经丘毛细胞

为了确定细胞自噬与毛细胞存活的关系,通过溶酶体标记物Lyso Tracker对神经丘的细胞自噬进行活体染色发现,斑马鱼(Danio rerio)经过苯基硫脲(PTU)处理后,其神经丘毛细胞Lyso Tracker信号强度增加,并伴随毛细胞数量增多和肿瘤抑制蛋白p53基因(Tumor protein p53 gene,tp53)上调。为了阐明毛细胞的存活和保护机制,通过CRISPR/Cas9技术构建了tp53突变体斑马鱼,发现该基因突变后不会影响斑马鱼神经丘毛细胞的数量,但抑制了PTU对神经丘毛细胞自噬的促进,神经丘毛细胞不再增多。研究结果表明:PTU可以通过上调tp53基因的表达,促进斑马鱼侧线神经丘毛细胞的自噬活性,进而促进毛细胞的存活,为保护毛细胞奠定了重要基础。

siRNA抑制GPX1表达对新霉素诱导HEI-OC1细胞凋亡的影响

目的分析抑制谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)对氨基糖苷类抗生素损伤HEI-OC1细胞凋亡的影响。方法首先将HEI-OC1细胞培养后采用免疫荧光法观察GPX1的表达;然后采用CCK8法计算不同浓度新霉素处理HEI-OC1细胞后细胞活力及其半抑制浓度(IC50);再设立对照组和新霉素组,对照组不进行任何处置,新霉素组给予新霉素处理,采用免疫荧光染色、qRT-PCR和Western blot法研究新霉素给药后GPX1的表达;第四步设立空白对照组、阴性对照组和实验组,空白对照组不进行任何处置,阴性对照组转染无意义的siRNA,实验组转染siRNA-GPX1,使用免疫荧光染色、qRT-PCR和Western blot法检测siRNA转染效率,CCK8法观察三组细胞活力变化;转染成功后后两组给予新霉素处理,采用免疫荧光法检测三组细胞活力,并采用免疫荧光染色、TUNEL染色和Western blot法检测三组细胞凋亡状况。结果在HEI-OC1细胞可见中GPX1表达,并且新霉素损伤后HEI-OC1细胞活力随着新霉素的浓度升高而降低,新霉素半抑制浓度为10 mM;新霉素组细胞的GPX1蛋白、mRNA表达水平(分别为0.21±0.07,0.35±0.08)均较对照组(分别为0.38±0.02,1.00±0.16)降低(均为P<0.05)。转染siRNA-GPX1后实验组的GPX1蛋白和mRNA表达水平相对于阴性对照组明显受到抑制,但实验组的细胞活力相对于阴性对照组没有明显变化(P>0.05);给予新霉素损伤后,与阴性对照组细胞计数(301.33±38.76个)比较,实验组的细胞计数(183.67±18.58个)明显减少(P<0.01);实验组TUNEL阳性细胞比例(22.76%±1.66%)高于阴性对照组(10.84%±3.38%)(P<0.01);实验组中Cleaved Caspase-3阳性细胞比例(47.20%±9.22%)高于阴性对照组(14.24%±1.45%)(P<0.001);相对于阴性对照组,实验组BCL-2的蛋白水平下降(P<0.05),BAX的相对蛋白水平升高(P<0.001)。结论抑制氨基糖苷类抗生素损伤毛细胞的GPX1表达可导致HEI-OCI细胞凋亡程度加重,表明GPX1可能具有抗凋亡的作用;GPX1可能成为预防氨基糖苷诱导耳毒性的新潜在靶标。