烧骨组织形态变化及DNA技术在个体识别中的应用

烧骨在火灾、焚尸、交通、爆炸等案件和事故的检材中具有特殊的地位。通过对不同条件焚烧下烧骨组织形态及DNA变化规律的研究,可为法医实践中烧骨的种属鉴定、性别及年龄判定提供准确的依据和标准,同时可利用残存的基因位点对烧骨残块进行个体识别和同一认定。烧骨DNA的提取方法及检测技术也在不断探索和改进。本文对烧骨在形态学、组织学和分子生物学水平研究进展以及烧骨评测的方法、技术进行概述,旨在为法医实践及进一步研究提供新的方法和思路。

烧骨DNA提取与检测技术的实验研究

目的探索烧骨DNA提取与检测方法。方法常压下以200℃分别对30例成人股骨焚烧1h后,生物冷冻研磨,EDTA脱钙,改良酚-氯仿提取DNA,光度计检测DNA浓度和纯度;5色荧光标记,PCR复合扩增,基因分析仪毛细管电泳,软件收集数据和分析。结果改良酚-氯仿法提取烧骨DNA浓度为(28.5±1.7)ng/μl,16个基因位点基本齐全,相对荧光单位(RFU)>500;传统酚-氯仿法提取烧骨DNA浓度为(4.7±0.8)ng/μl,基因位点检出不全,RFU<500。结论改良酚-氯仿法、PCR复合扩增、基因分析能对烧骨DNA进行有效提取和检测,但操作时要严格规程。

放射复合伤骨髓微环境中基质细胞的周期、DNA含量与形态变化的观察

用流式细胞仪、光镜、扫描电镜和透射电镜观察单纯放射损伤（单放组）、单纯烧伤（单烧组）和放射复合伤（复合伤组）小鼠骨髓基质细胞的细胞周期、ＤＮＡ含量和形态变化。结果：①单烧组骨髓基质细胞的Ｇ２＋Ｍ期比例、ＤＮＡ含量由高到低；单放组和复合伤组Ｇ２＋Ｍ期比例、ＤＮＡ含量则由低到高；②与正常组骨髓基质细胞相比，各损伤组均出现不同特征的形态学变化；③单放组的内质网扩张，线粒体基质变淡，嵴消失；单烧组的线粒体增多、肿胀；放射复合伤的线粒体重度退行性变，结构紊乱。提示：放射复合伤骨髓基质细胞的细胞周期比例、ＤＮＡ含量和形态的改变可能是导致放射复合伤造血微环境损伤的重要原因之一。

个体识别中烧骨的DNA提取

目的：探讨不同温度焚烧的股骨中的DNA的提取方法。方法：常压下以100℃～500℃对30例成人股骨进行焚烧，然后分别采用有机法、Microcon100＋Qiagen试剂盒（QIAquick PCR Purification kit）纯化法、有机法＋Qiagen试剂盒纯化法。并用ND-1000光度计进行DNA浓度测定，用Sinofiler扩增试剂盒进行荧光标记和复合扩增。结果：骨骼样本在20℃～500℃各组用3种方法检测的DNA浓度均值分别为10．1～0．0、67．2～0．0、49．8～0．0ng／μl。有机法在20℃～500℃各组的位点检出率为38．3％、28．3％、16．7％、9．4％、0．0％、0．0％；纯压法为97．3％、75．7％、45．6％、33．1％、12．5％、1．2％；有机法＋Qiagen试剂盒纯化法为98．5％、81．9％、53．5％、36．3％、7．7％、0．4％。结论：有机法提取的骨骼DNA浓度及位点检出率较其他两种方法低；未烧骨骼用后两种方法提取其DNA都能获得较高的浓度和较好的分型，焚烧温度在100~C～300℃之间的骨骼用有机法＋Qiagen试剂盒纯化法提取其DNA较好；400℃-500℃焚烧的骨骼用Microeon100＋Qiagen试剂盒纯化法提取其DNA较好。

一种焚烧骨骼的DNA提取方法

本文介绍了一种针对烧骨的DNA有效提取方法。对烧骨进行研磨制成骨粉,对骨粉进行大体系脱钙和裂解,采用Amicon~Ultra-15离心过滤器对获得的脱钙、裂解上清液进行浓缩,提高DNA的回收率,使用硅胶膜法对浓缩后的DNA溶液进行纯化,并经复合STR扩增检验。使用上述方法成功完成两起严重焚烧骨骼案件的检验,确定了受害人身源。

烧骨DNA检验技术的研究

目的解决陈旧性骨骼和烧骨DNA检验难题。方法研究建立了CTAB法裂解提取DNA,再用磁珠纯化得到的DNA提取液进行STR复合扩增检验。结果实验结果及实际检案显示研究所建立的骨DNA提取方法能较好地去除DNA扩增抑制物,得到高质量的DNA模板。结论本研究所建立的烧骨DNA检验方法其识别率为10×10-12,达到个人同一认定的目的,在解决实际工作中杀人焚尸案、火灾、爆炸等恶性案件和事故中有重要的作用。

骨胶原蛋白肽粉中DNA的提取及猪、羊源性成分的检测

目的优化深加工骨胶原蛋白肽粉中DNA的提取方法,鉴定检测其动物源性成分。方法采用2种试剂盒法,并对试剂盒部分步骤进行适度修改后提取骨胶原蛋白肽粉中的基因组DNA,分别用猪、羊引物和探针对提取的DNA片段进行实时荧光PCR扩增检测。结果只有DNeasy Blood&Tissue Kit提取试剂盒法提取的DNA纯度较好,A260/A280比值为1.73,浓度为8.2 ng/μL,并且经18S rDNA片段的PCR扩增结果表明样品中含有哺乳动物DNA,且DNA中不含抑制PCR反应物质。检测结果表明该骨胶原蛋白肽粉中含有猪源性成分。结论采用试剂盒法提取深加工骨胶原蛋白肽粉中DNA时,需对部分步骤做修改后才可进行。

不同温度焚烧对成人股骨16个基因位点的影响

目的：探讨不同温度焚烧后骨骼DNA浓度的变化以及16个基因位点的存留情况。方法：常压下以100-500℃对30例成人股骨进行焚烧，对其存留DNA进行浓度测定，用Identifiler^TMPCR试剂盒进行荧光标记和复合扩增，ABI3100xl Genetic Analyzer软件对DNA16个基因位点进行检测和分析。结果：骨骼样本提取的DNA浓度在50．6～0．0ng／μl之间。未烧和5个温度焚烧后基因位点存留不同，位点检出率分别为98．5％、82．7％、52．9％、35．0％、8．5％、0．4％。结论：温度对骨骼DNA的保存有很大影响，温度越低，保存越完整；片段越小，存留越多。

猪骨胶原蛋白肽缓解高脂饮食诱导小鼠肝脏氧化应激的基因芯片分析

本研究探讨猪骨胶原蛋白肽降血脂作用和抑制高脂饮食诱导肝脏抗氧化应激的作用机理。40只小鼠分为5组,分别饲喂6 w正常日粮、高脂日粮、添加1.6%钙的高脂日粮、添加1%胶原蛋白肽的高脂日粮和添加1.6%钙+1%胶原蛋白肽的高脂日粮。研究发现:与正常组相比,高脂日粮小鼠血脂和体重明显升高。1.6%钙处理可抑制体重过度升高,1%胶原蛋白肽和高钙可协同抑制调节血脂,防止体重升高。高脂主要通过影响肝脏生理节律和过氧化物酶体增生物激活受体信号通路引起脂代谢异常,高钙和骨胶原蛋白肽可显著抑制肝脏氧化应激,抑制生理节律紊乱。

联合偶合概率与似然比率在炭化骨骼个人识别中的计算及分析

目的探讨联合偶合概率(RMP)与似然比率(LR)在炭化骨骼个人识别中的计算方法及意义。方法常压下以300℃对两例成人股骨焚烧1h后,液氮下研磨得到骨粉,乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙,改良的酚-氯仿法提取DNA并纯化,5色荧光标记,PCR复合扩增,基因分析仪进行电泳,数据收集与分析。结果累积识别力(TDP,男):0.999 999 980 3,TDP(女):>0.999 999 999 999 99;RMP(男):2.322 5×10-12,RMP(女):4.931 3×10-24;LR(男):4.305 7×1011,LR(女):2.027 9×1023。结论 300℃炭化骨骼可提取到DNA,利用存留基因图谱比对及TDP、RMP、LR的计算可进行个人识别。

烧骨基因位点保存状况及检测方法比较

目的：探讨不同温度焚烧的股骨中基因位点的保存状况及其检测方法。方法：常压下以100℃～500℃对30例成人股骨进行焚烧，提取其存留DNA，用Identifiler试剂盒和Minifiler试剂盒进行荧光标记和复合扩增，ABI3130xl Genetic Analyzer软件对DNA基因位点进行检测和分析。结果：提取骨密质中的DNA可以获得正确分型，未烧和5个温度焚烧后基因位点存留不同，Mifiler试剂盒比Identifiler试剂盒更能从烧骨DNA中得到STR基因座分型结果。D21S11、FGA2个位点在2个试剂盒中的检出率差异无统计学意义。2个试剂盒中的FGA位点检出率都不高。结论：温度对骨DNA的保存有很大影响，检测焚烧程度高的骨骼DNA时用Minifiler试剂盒更容易得到基因分型结果。FGA位点不适合作为miniSTR位点用于检测烧骨等降解检材。

燃煤型氟中毒大鼠血清中Ⅰ型胶原交联N末端肽变化

目的观察血清Ⅰ型胶原交联N末端肽(NTX)在燃煤型氟中毒大鼠血清中的变化,探讨骨吸收在氟骨症发生中的地位。方法将160只断乳4周的SD大鼠随机分为对照组、低氟组、中氟组、高氟组,食用病区煤烘玉米,复制燃煤型氟中毒动物模型。分别于染毒后30 d、90 d、180 d分批处死动物,ELISA法检测血清NTX水平。结果随着染毒时间增加,各实验组尿氟、骨氟、氟斑牙发生率、股骨病理积分逐渐增加(P小于0.05)。实验不同阶段各实验组与对照组比较,差异具有统计学意义(P小于0.05),并有随着染氟剂量增加而增加的趋势(P小于0.05)。实验30 d和90 d时,各组NTX水平差异无统计学意义。实验180 d时,低氟组及中氟组NTX高于对照组及高氟组(P小于0.05)。结论在摄氟早期,氟未增强骨吸收,随着时间及染氟剂量增加,可促进骨吸收。

放烧复合伤小鼠骨髓基质细胞的周期、DNA含量与形态学变化

目的探讨放烧复合伤对骨髓造血微环境损伤的机制。方法采用流式细胞仪、光镜、扫描电镜和透射电镜观察５．０Ｇｙγ线放射损伤、１５％Ⅲ度体表总面积烧伤和放烧复合伤小鼠骨髓基质细胞的细胞周期、ＤＮＡ含量和形态学变化。结果随伤后时间的延长，单烧组骨髓基质细胞的Ｇ２＋Ｍ期比例、ＤＮＡ含量呈高→低的变化；单放组和复合伤组Ｇ２＋Ｍ期比例呈低→高的变化趋势，其ＤＮＡ含量的变化具有单放组和单烧组的特点。结论放烧复合伤骨髓基质细胞的细胞周期比例。

燃煤型氟中毒大鼠血清骨碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原羧基端前肽的变化

目的观察骨碱性磷酸酶(BALP)及Ⅰ型胶原羧基端前肽(CⅠCP)在燃煤型氟中毒大鼠中的表达变化,探讨骨形成在氟中毒骨病变中的地位。方法将断乳4周的SD大鼠160只随机分为对照组、低氟组、中氟组、高氟组(饲料氟:6.30、9.56、15.89、23.00 mg/kg),食用病区煤烘玉米,复制燃煤型氟中毒动物模型。分别于染氟后30、90、180 d以ELISA法检测血清BALP和CⅠCP水平。结果染氟30和90 d时各组动物血清BALP水平差异无统计学意义,180 d时中氟组、高氟组BALP均高于对照组和低氟组(P<0.01)。染氟30 d时高氟组血清CⅠCP水平低于对照组(P<0.05);90 d时中氟组和高氟组血清CⅠCP水平均高于对照组(P<0.05),且有随着剂量增加而增加的趋势;180 d时各组动物血清CⅠCP水平高于对照组(P<0.01),且有随着剂量增加而增加的趋势。结论氟可以使大鼠骨形成加速,且氟对CⅠCP表达的影响较BALP显著。

燃煤型氟中毒病区成人血清骨碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原羧基端前肽浓度变化

目的探讨燃煤型氟中毒病区成人血清骨碱性磷酸酶(BALP)及Ⅰ型胶原羧基端前肽(CⅠCP)的浓度变化。方法于2013年9月对贵州省六盘水市陡菁乡(病区组)102名成人和花嘎乡(对照组)45名成人进行氟斑牙检测,测定血清中BALP及CⅠCP浓度水平。结果病区组成人氟斑牙检出率(79.41%)高于对照组(11.11%),差异有统计学意义(P<0.01)。病区组成人尿氟浓度中位数(1.59 mg/L)高于对照组(0.65 mg/L),差异有统计学意义(P<0.01)。病区组成人血清CⅠCP浓度中位数(418.12 ng/ml)与对照组(435.08 ng/ml)差异无统计学意义(P>0.05);BALP浓度中位数(10.93 pg/ml)高于对照组(8.03 pg/ml),差异有统计学意义(P<0.01)。病区组女性血清BALP浓度中位数(11.66 pg/ml)高于对照组女性(8.18 pg/ml),差异有统计学意义(P<0.01)。结论氟可致成人血清BALP水平升高,成骨细胞活性增加,女性血清BALP较男性对氟更敏感。