花鲈肠上皮细胞原代培养及鉴定方法的探讨研究

为探究建立稳定可靠的花鲈肠上皮细胞原代培养方法,通过组织块法和酶消化法培养花鲈肠上皮细胞,确定酶消化法的最佳消化液及消化时间,所得细胞悬液于L-15培养液中进行培养。利用形态学观察、透射电镜观察和碱性磷酸酶染色方法对细胞进行鉴定。结果显示:组织块法细胞迁出情况不稳定,且迁出时间较长;酶消化法的最佳消化液为胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液,最佳消化时间为45 min;胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化法获得的细胞连接紧密、排列整齐、呈上皮细胞典型的“铺路石”状,细胞相对独立、界限清晰。透射电镜观察和碱性磷酸酶染色进一步证实所培养的细胞为肠上皮细胞。总之,经胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液消化45 min、培养48 h可得到初始条件一致、生长旺盛的花鲈原代肠上皮细胞。

具有抗氧化能力的人脐带间充质干细胞制备及评价策略研究

目的:从人脐带中分离制备一种具有抗氧化能力的间充质干细胞(antioxidant mesenchymal stem cell,AO-MSC)并评价其细胞生物学特性。方法:采用无血清培养体系,结合胶原酶消化培养法以及胶原酶消化组织块培养法,从人脐带华通氏胶组织分离培养MSC。使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化,未完全消化的组织块贴壁培养收获AO-MSC。以常规消化培养法为对照。成纤维细胞集落形成实验检测MSC集落形成能力;CCK-8检测MSC增殖能力;流式细胞术及免疫荧光染色检测MSC表面标志物;体外诱导分化评价MSC成脂成骨能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测成骨和成脂关键转录因子的表达差异;RT-qPCR检测MSC抗氧化还原物质SOD-1、GSH、GAT、NQO1的表达情况。结果:本策略分离的AO-MSC在18 d汇合率为80%-90%,细胞呈漩涡状生长。流式细胞术及免疫荧光染色检测结果显示,AO-MSC高表达CD73、CD29、CD105、CD90,低表达CD31、CD45、HLA-DR;胶原酶消化组织块培养法收获的AO-MSC自我更新及分化能力强于对照组MSC;对照组MSC体外成脂成骨能力强于胶原酶消化组织块培养法所得AO-MSC;RT-qPCR检测结果显示,胶原酶消化组织块培养法收获的AO-MSC其表达的抗氧化还原物质水平高于对照组。结论:成功制备了基于无血清体系的具备抗氧化能力的人脐带MSC。

改良酶消化法体外培养、纯化分离人颞下颌关节滑膜A型细胞

目的探讨获取人颞下颌关节滑膜A型细胞的较佳方法,为A型细胞的进一步研究奠定基础。方法分别用组织块法、传统酶消化法与改良的酶消化法培养滑膜细胞,观察培养3 d、7 d、2周、4周时细胞生长情况,记录首次传代时间。通过免疫组化检测衬里层细胞CD68、组织蛋白酶S的表达来检测A型细胞吞噬功能。结果滑膜组织块法接种约7 d后部分组织块周围有细胞游离出来,约4周后滑膜细胞长势接近80%融合密度,可进行首次细胞传代。传统酶消化法细胞贴壁缓慢,4周时才能观察部分细胞团形成,向周围呈放射状生长,约6周后才可首次传代。改良酶消化法接种3 d后,光镜下观察部分单个细胞贴壁,有一些胶原酶未消化完全而又能经过研磨透过滤网的微小组织块或细胞团块,在贴壁后迅速向周围增殖,约2周后可首次传代,3周后再次传代的细胞量与组织块法4周后首次细胞传代时间相同。免疫组化检测CD68有阳性表达,细胞位于靠近关节腔侧,组织蛋白酶S未见阳性表达。结论改良的酶消化法培养对比组织块法、传统酶消化法,在获得相同细胞量的基础上,缩短了原代细胞培养时间。改良酶消化法传代时A型细胞尚在存活期间,给后期A型细胞纯化分离奠定了基础。巨噬细胞标志物Cathepsin S在A型细胞上无表达,提示A型细胞由于体内局部环境的作用,已有别于巨噬细胞。

玉竹多糖对人脐带间质干细胞培养的影响研究

目的:探究培养液中添加玉竹多糖对人脐带间质干细胞(hUC-MSCs)培养的影响。方法:比较在培养液中添加玉竹多糖和传统培养方法得到的人脐带间质干细胞,在形态、稳定性、产量、细胞分化等指标上的区别。结果:测得传统酶消化法P0代细胞每瓶(T75)收获细胞总量为4.53×10^(6)cells、活率95.5%,而添加玉竹多糖的酶消化法收获细胞总量为5.35×10^(7)cells、活率97.9%;定向诱导分化两种方法得到的hUC-MSCs,无明显差异。结论:与传统酶消化法相比,添加玉竹多糖的酶消化法可以提高细胞产量、缩短生产时间,利于细胞的大规模化生产,且细胞分化无明显差异,能满足生产和临床需求。

Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞

背景:目前关节软骨细胞的分离培养技术已经比较成熟,但是研究中发现通过目前技术培养的软骨细胞生长周期慢,容易出现退变现象,不利于后续试验的进行。目的:改进并探讨4周龄新西兰大白兔膝关节软骨细胞的分离与培养的方法。方法:无菌条件下取4周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法,分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养;采用形态学观察,甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对关节软骨细胞进行鉴定;MTT法检测关节软骨细胞增殖情况。结果与结论:倒置显微镜下见膝关节软骨分离的原代软骨细胞6 h后开始贴壁,72 h可形成单层,96 h即可传代;前3代软骨细胞表型稳定,增殖力良好;第4,5代软骨细胞增殖能力减弱,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色,细胞核染成深蓝色;免疫组织化学显示软骨细胞Ⅱ型胶原呈黄褐色阳性表达;MTT法检测表明前3代软骨细胞增殖差异无显著性意义(P>0.05),且第1-3代与4代软骨细胞在培养第4-7天时,吸光度值差异有显著性意义(P<0.05),与第5代软骨细胞在培养1-7天时,吸光度值差异有显著性意义(P<0.05)。提示采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法能够获得大量生长速度快且不宜退变的新西兰大白兔膝关节软骨细胞,且培养的前3代新西兰兔膝关节软骨细胞最为适宜。

植块法与酶消化法结合培养原代大鼠雪旺细胞

目的:探讨利用植块法与酶消化法相结合培养大鼠原代雪旺细胞的可行性,并研究其增殖规律。方法:取10只新生2～3d的SD大鼠双侧坐骨神经,剥除神经外膜,剪成约1mm3大小的碎块,用0.03%胶原酶和0.25%胰蛋白酶按1∶2对神经碎块消化12min,加入少量含10%胎牛血清的DMED培养基小心吹打细胞及组织块,再植于培养皿中培养。用S-100免疫组化染色鉴定雪旺细胞,结合Hoechst3342染色计算其纯度,在显微镜下确定细胞数量。结果:在植块培养24h后即有大量细胞迁出,2～6d细胞生长迅速,10d以后生长较为缓慢,其倍增时间为2.3d。经S-100染色证实所培养细胞为雪旺细胞,结合Hoechst3342染色可得其培养8d时纯度为95.1%,传代后纯度可达96.3%。10只新生鼠培养12d后可得细胞数约为4.8×106个。结论:利用植块法与酶消化法相结合的方法可以迅速获得大量高纯度的雪旺细胞,其增殖速度在前6d最快,倍增时间为2.3d。

新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离

背景:利用心肌组织中不同细胞的黏附特性差异,通过优化心肌细胞的培养条件,一次分离同时获得心肌和心肌成纤维细胞。目的:探讨新生大鼠心肌和心肌成纤维细胞同时分离的有效方法。方法:采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶复合消化,差速分离心肌和心肌成纤维细胞。通过使用不同种类的血清改良心肌细胞培养条件,免疫荧光鉴定心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度。结果与结论:心肌培养48h时TroponinT阳性细胞率为89.3%。第2代的心肌成纤维细胞培养波形蛋白阳性细胞率为93.6%。含马血清的培养基组心肌细胞阳性率明显高于牛血清培养组(P<0.05)。实验应用的新生大鼠心肌细胞分离培养方法,心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度高、活性好,且能同时获得心肌细胞和心肌成纤维细胞。

改进的酶消化法培养新生大鼠Müller细胞

目的通过改进的酶消化法,简化Muller细胞的培养和纯化过程。方法采用将眼球培养前处理和机械吹打、贴壁后反复胰蛋白酶消化的方法培养新生大鼠Muller细胞,进行免疫组织化学染色和光电镜观察。结果培养的Muller细胞光镜下胞体较大,胞浆丰富,电镜下细胞器丰富,可见糖原和直径为10nm的微丝,免疫组织化学示95%以上细胞谷氨酰胺合成酶阳性,神经胶质纤维酸性蛋白阴性。结论改进的酶消化法是一种简单可行的Muller细胞培养方法。

改良酶消化法在人脑胶质瘤细胞快速原代培养中的应用

目的建立一种人脑胶质瘤细胞原代培养的改良酶消化法。方法基于文献并结合实际工作中经验,改良既往文献报道的酶消化法,对32例不同级别的胶质瘤进行消化后行原代细胞培养,通过倒置相差显微镜观察肿瘤细胞的形态学特点,传代时采用差速贴壁法对原代细胞进行纯化。采用细胞免疫荧光法对原代细胞进行鉴定,通过细胞增殖实验(CCK-8法)绘制生长曲线,研究体外培养细胞的增殖情况。结果采用改良的酶消化法成功培养28例,失败4例,成功率为87.5%。培养成功的细胞贴壁生长,细胞状态稳定,形态各异,生长状态良好,并可传代。细胞免疫荧光检测显示胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性,证明培养的细胞为胶质瘤细胞;细胞增殖实验显示细胞在体外增殖活跃,肿瘤病理级别越高,细胞增殖能力越强。结论改良的酶消化法用于人脑胶质瘤细胞原代培养具有简单、高效、成功率高等优点。

胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是目前国际上公认的人胚胎干细胞(hESCs)体外培养的饲养层细胞,但MEFs存在寿命短、动物源性污染等问题,需要探索适于hESCs体外培养且寿命长的人源性饲养层.采用胰蛋白酶消化法和组织块法分别原代培养人包皮成纤维细胞(hFFs),探索hFFs原代培养的最佳方法,为hFFs作为饲养层在hESCs研究中的应用提供可靠的科学依据;通过倒置显微镜下观察其生长状态和免疫细胞化学染色鉴定,结果显示两种原代培养方法获得的hFFs的形态及生物学特性均符合成纤维细胞;通过测定细胞生长曲线及MTT法检测,结果显示两种原代培养方法获得的不同代数的hFFs均具有较高的增殖活性,传代10余代仍能保持较好的细胞形态,可以制备成饲养层用于hESCs的研究.

Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶在原代成骨细胞培养中消化效果的对比研究

目的:比较Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶在原代成骨细胞培养中的消化效果。方法:取6只新生24 h内的SD大鼠,处死后取出颅盖骨并制成碎骨片。将碎骨片等分成2份,标记为Ⅰ组和Ⅱ组,分别用0.1%Ⅰ型胶原酶和0.1%Ⅱ型胶原酶在37℃消化2次,每次1 h。将2次消化所得到的细胞悬液混匀后进行细胞培养,并对2组细胞分别进行细胞计数,观察细胞形态、细胞增殖情况及碱性磷酸酶染色情况,并测定碱性磷酸酶含量。结果:①细胞计数。Ⅰ组细胞3次细胞计数结果分别为6.20×105个.mL-1、6.00×105个.mL-1、5.90×105个.mL-1;Ⅱ组细胞3次细胞计数结果分别为3.20×105个.mL-1、3.40×105个.mL-1、2.90×105个.mL-1。Ⅰ组细胞总量为Ⅱ组细胞总量的2倍左右。②细胞形态。2组细胞多呈梭形,表面有2～3个突触与周围细胞相联系,2组细胞形态无明显差异。③细胞增殖。Ⅰ组光密度(0.492±0.001)与Ⅱ组光密度(0.491±0.002)比较,差异无统计学意义(t=0.379,P=0.713)。④碱性磷酸酶染色。2组细胞用苏木素染色后,胞浆内均可见明显的咖啡色和红棕色颗粒。⑤碱性磷酸酶含量。Ⅰ组碱性磷酸酶含量[(2.929±0.024)金氏单位]与Ⅱ组[(2.933±0.024)金氏单位]比较,差异无统计学意义(t=0.389,P=0.706)。结论:Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶均适用于成骨细胞的原代消化,但在消化1 h×2次条件下用Ⅰ型胶原酶容易获得更多的成骨细胞。

无血清悬浮法培养MCF-7细胞系并筛选该细胞系中肿瘤干细胞相关亚群的初步研究

目的:研究无血清培养基悬浮培养MCF-7乳腺癌细胞系,筛选并鉴定MCF-7乳腺癌细胞系中的肿瘤干细胞相关亚群。方法:应用乳腺癌培养基在无血清的条件下悬浮培养MCF-7乳腺癌细胞系。通过无血清培养筛选乳腺癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群,将其接种于含血清培养基,观察分化。应用单克隆形成实验、表面标志检测、HOECHST33342染色检测来确定培养出的细胞中肿瘤干细胞的比例及其培养后肿瘤干细胞含量的变化。结果:乳腺癌MCF-7细胞系中有约2.12%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由漂浮的细胞球。细胞球可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养的MCF-7无明显差别。流式细胞仪表面标志检测,细胞球中约含83.13%表达CD24-CD44+的细胞,HOECHST33342染色提示细胞球中约含10.06%的侧亚群(sidepopulation)细胞。结论:MCF-7细胞系可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。该细胞系中含有比例较低的具有增殖和分化能力的乳腺癌干细胞相关亚群。表面标志以及HOECHST33342检测差异提示细胞球中仅约1/8细胞具有干细胞的功能。

绒山羊附睾上皮细胞培养方法的建立及其生长特性

本研究旨在建立一种简单易行、获取细胞纯度高的绒山羊附睾上皮细胞体外培养体系。10~12月龄绒山羊附睾头部分别采用酶消化法和改良组织块消化法进行原代培养,利用免疫细胞化学染色法和免疫荧光化学法对细胞进行鉴定,同时利用流式细胞仪和CCK法分别检测细胞纯度和增殖情况,在电镜下观察细胞超微结构。结果表明,两种培养方法所获的细胞均呈岛屿状克隆生长和较好的增殖能力,具有活跃的分泌和代谢功能;上皮细胞特异性的角蛋白18和附睾特异性的谷胱甘肽过氧化物酶5(GPx5)的表达以及流式细胞仪结果显示,两种方法所获细胞均为纯度较高的附睾上皮细胞,但改良组织块消化法获得原代细胞需要的时间长,酶消化法获得原代细胞时间短,获得的细胞量大。本研究结果为进一步研究绒山羊附睾上皮功能提供了良好的基础。

中华鳑鲏皮肤细胞的分离及其细胞系的建立

采用对传统酶消化法稍进行改进建立了中华鳑鲏皮肤细胞的分离方法,获得RSDCs株(系)以便用于后续关于中华鳑鲏体色细胞研究。结果显示,对中华鳑鲏抑菌暂养8~24 h后,0.25%胰酶—EDTA消化处理3~5 min,用手术刀片顺鳞片方向刮除鳞片,在体式显微镜下解剖获得鱼类皮肤,采用IV型胶原酶—胰酶联合消化皮肤获得单细胞;获得的RSDCs于28°C,5%CO_2条件下进行培养,采用血球计数板计数法测定绘制了RSDCs生长曲线;采用RT-PCR的方法检测RSDCs F_0、F_5和F_(10)上皮标记物(Keratin 18和Vinculin A)和内皮标记物(Collagen I)的表达情况。成功分离获得RSDCs细胞株(系);RSDCs以1×10~4个/cm^2接种,倍增时间为30 h左右,呈典型的"S"型,与贴壁细胞的体外增殖行为一致;RT-PCR结果显示,随着传代次数的增加上皮标记物表达呈现下降趋势,而内皮标记物表达呈上升趋势。研究表明,改良的酶消化法能够成功分离获得RSDCs株(系);获得RSDCs体外培养生长曲线呈典型的"S"型,与贴壁细胞的体外增殖行为一致;分离获得RSDCs由上皮细胞和内皮细胞构成,但随着传代次数的增加,上皮细胞所占的比重越来越小。

组织块结合酶消化法培养婴幼儿血管瘤内皮细胞

目的:探讨血管瘤内皮细胞体外培养的方法并观察其生物学特性。方法:收集新鲜手术切除的婴幼儿血管瘤标本,采用组织块结合酶消化法培养内皮细胞,免疫组化EnVision法对培养的细胞进行鉴定;流式细胞仪FITC-CD34检测内皮细胞纯度;相差显微镜下观察血管瘤内皮细胞的生物学特性。结果:共收集血管瘤标本14例,有8例成功培养出内皮细胞,内皮细胞呈现两种形态:多角形和梭形,经免疫组化鉴定为内皮细胞;培养的细胞中CD34+细胞数为76.28%;血管瘤内皮细胞有明显的"管腔形成"。结论:组织块结合酶消化法能成功培养较纯的婴幼儿血管瘤内皮细胞,培养的内皮细胞具有某些生物学特性。

人髓核细胞分离、传代培养方法的建立及意义

目的建立一种体外分离、培养人髓核细胞(NPCs)的新方法,并探讨其意义。方法采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化法分离人正常NPCs,单层贴壁法进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态。取第1、2、3代NPCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力(以吸光度值表示),连续检测12天。取第2代NPCs,采用免疫组化法检测Ⅱ型胶原(Col-2)、细胞角蛋白18(KRT-18)、KRT-19、低氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运子1(GLUT-1)、Sox-9、聚集蛋白聚糖(ACAN)、CD24阳性表达率。结果分离的NPCs呈多角形或短梭形,类似于软骨细胞;第4代以后,NPCs细胞突起延长,呈长梭形,生长缓慢,出现老化现象。NPCs生长曲线呈S形:1~2天细胞生长缓慢;3~7天细胞生长迅速,进入对数生长期;8天后进入平台期,细胞增殖缓慢。连续培养12天,第1、2、3代NPCs相同时间点吸光度值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。第2代NPCs中Col-2、KRT-18、KRT-19、HIF-1α、GLUT-1、Sox-9、ACAN、CD24阳性表达率均≥85.6%(85.6%~91.2%)。结论单纯0.2%Ⅱ型胶原酶消化法及单层贴壁法可分离、培养人NPCs,并经免疫组化染色鉴定证实;传代3代以内的NPCs细胞形态及增殖能力均无明显改变,可作为椎间盘退变相关研究的种子细胞。

一种快速、经济、省时的施万细胞体外培养和纯化方法

目的探讨一种快速、简单、经济的施万细胞(SCs)培养和纯化方法,为SCs体内移植研究提供稳定及可靠的细胞来源。方法选用SD乳鼠,取坐骨神经和臂丛神经,用单细胞双酶消化法和半植块单酶消化法培养SCs。结果用同样多的组织材料,半植块单酶消化法所获得的SCs比单细胞双酶消化法所获细胞至少多两倍,省时40min。免疫组织化学染色显示,获得的施万细胞96%以上呈S-100阳性。结论用半植块单酶消化法培养SCs,可以在短时间内获得足够数量和足够纯度的SCs。

大肠癌细胞的原代培养方法

目的:探讨大肠癌细胞体外分离培养方法,建立合理、高效、稳定的短期大肠癌细胞原代培养模式。方法:取60例大肠癌(T3或T4,且CT示肿瘤直径>2.0 cm)的新鲜肿瘤组织,随机分为黏膜层取材组与浆膜层取材租,分别采用组织块法、机械分离法、胰酶消化法、胶原酶消化法进行体外培养大肠癌细胞,对不同方法及培养条件进行比较并加以改进。结果:黏膜层取材组优于浆膜层取材组(P<0.05),胶原酶消化法优于胰酶消化法(P<0.05),胰酶消化法优于机械分离法(P<0.05),胶原酶消化法是最优的人类大肠癌细胞原代培养方法,细胞培养成功率达到66.7%。结论:通过黏膜层取材的胶原酶消化法可成功建立较为合理、高效、稳定的短期大肠癌细胞原代培养模式。

乳鼠皮层神经元原代培养与观察

目的:通过原代培养乳鼠皮层神经元,为脑血管疾病的研究提供实验模型。方法:酶消化法原代培养出生1天Wistar乳鼠的皮层神经元,利用免疫细胞化学和免疫荧光方法进行鉴定。结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长。免疫细胞化学染色显示神经元特异性烯醇化酶阳性细胞达85%,免疫荧光显示胶质细胞酸性蛋白阳性细胞达15%。结论:酶消化法原代培养乳鼠皮层神经元是一种可靠、稳定的获得神经元的方法。

原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为

背景:增生性瘢痕组织的形成是创面愈合过程中不可避免的,但是增生性瘢痕组织的形成产生很多不良的影响。目的:建立可靠的人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养方法。方法:采用组织贴壁法和消化法分别进行人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养,使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,体积分数5%CO2,饱和湿度下培养,分别描述其生长曲线、形态及波形蛋白的表达。结果与结论:组织贴壁法人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养成功,20-40d可传第1代,以后每7-10d可传1代,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性;消化法培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞成功,15-20d细胞可融合成片,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性。进一步证实两种方法进行人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养均培养成功。