产色素温和气单胞菌的特性及其外膜蛋白型研究

[目的]研究产色素温和气单胞菌的致病机理。[方法]从不同来源的病鳖和病鳗体内分离到4株产生棕色色素温和气单胞菌,并采用平板法进行检测。[结果]对鲫鱼胸基部注射9×108cfu/ml菌悬液0.4ml后,BA10、BA15和BA16株对鲫鱼的致死率在33.3%以上,M1株对鲫鱼无致死性。采用超声波破碎-SI法提取外膜蛋白(OMPs),SDS-PAGE电泳结果显示,4株温和气单胞菌的外膜蛋白相对分子质量范围在20.1～66.2kDa,其中1个鳗鱼分离株M1株属OMP1型,由8条主要蛋白带组成;其余3个鳖源分离株BA10、BA15和BA16株属OMP2型,由9条主要蛋白带组成。[结论]产色素与致病性无相关;4株产色素温和气单胞菌之间存在共同抗原;产色素温和气单胞菌的OMP型可能与菌株来源有关。

19株海水鱼致病性弧菌OmpK基因序列及其抗原性分析

从哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)克隆、测定了共19株海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,探讨其作为海水鱼类致病性弧菌共同抗原的分子基础。根据已知的弧菌外膜蛋白OmpK序列设计1对简并引物,利用聚合酶链式反应(PCR)方法从19株弧菌总DNA中分别扩增得到约800 bp外膜蛋白OmpK的基因片段,将其克隆到pDM18-T Vector载体筛选阳性重组子进行序列测定。结果显示,OmpK基因分别含有786 bp^849 bp的开放读码框,编码261~282个氨基酸,其核苷酸序列之间的相似性在72%~100%,推测氨基酸序列的相似性为71%~100%,且种内OmpK氨基酸序列的相似性比种间高。序列分析还表明,每一种弧菌OmpK基因都有一段特异性序列,可用于设计核酸探针或特异性引物来诊断、检测哈维氏弧菌等海水鱼致病性弧菌。本研究不仅从基因水平上证实了外膜蛋白OmpK广泛存在于海水鱼致病性弧菌中,而且证明了它们之间具有较高的相似性。由结果推测外膜蛋白OmpK是哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌的一种共同抗原,是较好的亚单位疫苗候选成分,为进一步研制广谱的海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗提供了理论基础。

致病性嗜水气单胞菌保护性抗原的研究

本试验采用SDS－PAGE对10株嗜水气单胞菌（Ah）的外膜蛋白（OMP）和脂多糖（LPS）进行分析，结果显示大多数菌株具有相似的OMP图谱，而LPS则有较大的差异，用鲫鱼抗AhJ-1株全菌血清进行免疫转印，发现S蛋白（S－layerProtein）是70％Ah菌株的共同抗原，而LPS则有明显的抗原多样性，AhJ－1株抗血清仅能与同源菌株起反应。用AhJ－1株HEC毒素（Hemolvticactivity，Enterotoxicity，Cytotoxicity，HEC）的单克隆抗体检测此10株Ah，8株细菌可产生抗原性相同的HEC毒素。用纯化的AhJ－1株的S蛋白、LPS及HEC毒素（预先天活）分别免疫小鼠，强化免疫后，对同源菌株的攻击均能完全保护；S蛋白免疫组和HEC毒素免疫组对异源菌株TPS－30的攻击均能保护，而LPS免疫组则不能完全保护。上述结果表明，S蛋白和HEC毒素是Ah的主要共同保护抗原。AhJ-1株有望成为预防嗜水气单胞菌败血症的疫苗生产菌株。

大豆抗原蛋白Glycinin对鲤稚鱼和幼鱼肠道组织的影响

【目的】研究大豆抗原蛋白大豆球蛋白(Glycinin)对鲤稚鱼、幼鱼肠道组织的影响。【方法】分别以初始体质量为(10.12±0.08)g/尾的鲤稚鱼、(116.89±0.13)g/尾的鲤幼鱼为试验对象,在控温单循环养殖系统中进行饲养试验。以鱼粉为动物蛋白源,混合油脂(m(玉米油)∶m(鱼油)=1∶1)为脂肪源,糊精、面粉作为饲料糖源,分别配制成5种等氮(鲤稚鱼和幼鱼饲料粗蛋白含量分别约为400和360g/kg)等能(总能分别约为16.9和15.2MJ/kg)的半精制饲料,其中大豆抗原蛋白Glycinin的添加量分别为0(对照),30,60,90,120g/kg。每组饲料设3个重复,进行为期8周的饲养试验。饲养试验结束后,采用组织学方法,探讨大豆抗原蛋白Glycinin对鲤稚鱼、幼鱼肠道组织的影响。【结果】在本试验条件下,大豆抗原蛋白Glyicinin添加量为30,60,90,120g/kg组的鲤稚鱼中肠和后肠皱襞高度显著低于对照组(P<0.05);而前肠皱襞高度、肠质量、肠长、肠体指数和肠长指数在各组之间差异不显著(P>0.05)。随着大豆抗原蛋白Glycinin添加量的增加,鲤幼鱼前肠、中肠和后肠皱襞高度呈下降趋势。其中,大豆抗原蛋白Glyicinin的添加量为60,90,120g/kg组鲤幼鱼后肠皱襞高度、肠质量显著低于对照组(P<0.05);而Glyicinin的添加量为120g/kg组鲤幼鱼肠长和肠长指数显著低于对照组(P<0.05);前肠和中肠皱襞高度在各组之间差异不显著(P>0.05)。从肠道形态变化来看,当Glyicinin添加量为60g/kg时,鲤稚鱼肠绒毛开始出现局部断裂或破损;当Glyicinin添加量为90和120g/kg时肠道组织形态进一步被破坏,中肠和后肠受到Glycinin的影响较严重。当Glyicinin添加量为60g/kg时,鲤幼鱼肌层开始出现变薄的现象;当Glyicinin添加量为90和120g/kg时,肠道形态受到的影响较显著,绒毛出现断裂或者缺失。【结论】当鲤稚鱼饲料中大豆抗原蛋白Glyicinin的添加量为30g/kg时,就会引起中肠和后肠皱襞高度下降;而当Glyicinin的添加量为60g/kg时会引起鲤幼鱼后肠皱襞高度下降,同时鲤稚鱼和鲤幼鱼肠道形态开始出现不同程度的破坏。

不同大豆制品对鲤生长和蛋白质代谢的影响

选择健康的鲤鱼种[体重为(5.89±0.36)g]为试验鱼,以生大豆粉和不同处理的大豆制品分别替代鱼粉,大豆蛋白分别替代50%的鱼粉蛋白,配制5个等蛋白(可消化蛋白30%)、等能(可消化能15MJ/kg)的半精制饲料,探讨大豆抗营养因子的不同和叠加对鲤生长和蛋白质代谢的影响。结果表明,热处理大豆组平均增重率与对照组差异不显著(P>0.05),生大豆组的平均增重率显著低于对照组(P<0.05)。化学钝化组、热处理大豆组和酒精浸提组之间没有显著差异(P>0.05),但都显著高于生大豆组(P<0.05)。对照组的鲤肠道和肝胰脏蛋白酶的活力显著高于生大豆组和酒精浸提组(P<0.05),但与化学钝化组和热处理大豆组差异不显著(P>0.05)。鱼粉组白肌RNA的含量与热处理大豆组没有显著差异(P>0.05),但二者都显著高于生大豆组、化学钝化组和酒精浸提组(P<0.05)。鱼粉组白肌RNA/DNA与热处理大豆组和化学钝化组没有显著差异(P>0.05),但三者都显著高于生大豆组和酒精浸提组(P<0.05)。白肌RNA和血清IGF-I水平与生长正相关(P<0.05)。在本试验条件下,表明热处理大豆组要好于其他各处理组,大豆抗营养因子对鱼类负面影响程度的顺序是抗胰蛋白酶抑制因子>凝集素>大豆抗原蛋白,适当的处理可降低抗营养因子的负面影响。

狐阴道加德纳氏菌共同抗原蛋白免疫活性的研究

对狐阴道加德纳氏菌三个血清型的共同抗原蛋白进行免疫印迹试验，结果证实，４条共同抗原蛋白带中，只有７４．１Ｋ蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ呈现阳性反应，从凝胶中提纯７４．１ＫＤ蛋白免疫小鼠，免疫后３５ｄ采血分离血清，以ＤＯＴ－ＥＬＩＳＡ进行检测，血清抗体呈现阳性反应，证实７４．１Ｋ蛋白能产生免疫应答。

嗜水气单胞菌主要外膜蛋白对欧洲鳗鲡的免疫保护试验

制备出4株分属3个不同血清型嗜水气单胞菌的主要外膜蛋白(MOMP)免疫刺激复合物(ISCOMs)亚单位疫苗,腹腔注射免疫欧洲鳗鲡,ELISA法测得免疫后第14d和第30d所采集的血清的平均抗体效价在1∶320—1∶1280之间。免疫印迹结果显示,在印迹膜上对应的位置均可检测到MOMP的主要蛋白条带。第40d的免疫保护试验表明,免疫欧鳗对TPS-30菌株约100倍半数致死剂量的攻击无免疫保护作用,其中的3组被测免疫欧鳗对TPS-30菌株约10倍半数致死剂量的攻击的免疫保护率皆在80%以上。上述试验结果提示,嗜水气单胞菌的主要外膜蛋白是重要的保护性抗原,在制备成ISCOMs亚单位疫苗的情况下,较小的剂量免疫一次即可显示出较高的相对免疫保护率,且没有明显的血清型特异性。

鸭疫里默氏杆菌重组蛋白P25间接ELISA检测方法的建立

以鸭疫里默氏杆菌血清1型(RA 1)基因组文库中筛选获得的一种"保守假定蛋白P25"基因的重组表达产物为包被抗原,建立了检测RA血清抗体的间接ELISA。诱导表达的重组P25蛋白纯化后进行包被,十字交叉滴定试验确定,此ELISA的最适抗原包被浓度为0.6μg/mL,血清最佳稀释度为1∶64,与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌感染鸭血清无交叉反应。以RA 1的P25为包被抗原对RA 2、5、8、10血清型的标准分型血清和经临床剖检诊断的病鸭血清进行检测,其结果均为阳性。以RA 1型的P25基因设计的特异性引物分别扩增出了RA 2、5、8、10的P25基因。所扩增的P25基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列和抗原表位在这些不同血清型间高度保守,提示此P25蛋白是各种血清型RA间的共同抗原,所建立的ELISA可以用于检测不同血清型RA的感染。

鸡球虫共同抗原UCE免疫原性分析及其对多种球虫感染的免疫保护效果评估

[目的]在前期研究中,筛选到了存在于多种鸡球虫间的共同抗原泛素缀合酶结构域蛋白(UCE),本研究进一步分析其免疫原性,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[方法]提取纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增堆型艾美耳球虫UCE基因(EaUCE),插入pVAX1质粒,构建真核表达质粒pVAX-EaUCE,通过RT-PCR和Western blot检测pVAX-EaUCE在鸡体内的转录和表达情况。经流式细胞术和间接ELISA法检测pVAX-EaUCE免疫后鸡体细胞免疫和体液免疫水平变化,分析其免疫原性。分别采用柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫及三者的混合卵囊人工感染雏鸡,观察感染前、后雏鸡体质量变化和排出卵囊减少量,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[结果]EaUCE基因开放阅读框为444 bp,编码148个氨基酸,BLAST分析显示,柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫UCE氨基酸序列同源性均大于95%。pVAX-EaUCE能够在鸡体内成功转录和表达。pVAX-EaUCE免疫后,鸡体的CD_4^+/CD_3^+和CD_8^+/CD_3^+细胞比例显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D、TGF-β4 mRNA和IgY抗体水平显著升高,表明免疫该质粒能诱导细胞和体液产生免疫反应(P<0.05)。pVAX-EaUCE免疫后,与对照组相比,免疫组鸡体质量显著增加,卵囊产量明显下降,肠道损伤也相应减轻。[结论]鸡球虫共同抗原UCE具有良好的免疫原性,可对多种球虫感染提供部分免疫保护力,有望成为抵抗多种球虫感染的候选抗原。